Azul de metileno e ferroptose: ferro, peroxidación lipídica e morte celular

A ferroptose é a morte celular causada polo dano nas membranas. As graxas poliinsaturadas das membranas oxídanse nunha reacción en cadea, a membrana deixa de funcionar e a célula morre. O ferro é necesario para esta reacción química. Esa frase resume todo o concepto, e todo o que se presenta neste artigo pon a proba unha parte del.

Aquí a pregunta é máis concreta: que lle fai o azul de metileno a esa cadea nos experimentos celulares e que demostra realmente ese resultado. A resposta breve é que, en dous estudos de laboratorio, o azul de metileno en concentracións nanomolares reduciu a peroxidación lipídica mitocondrial e mantivo vivas as células tras estímulos que, doutro xeito, causan ferroptose. A resposta longa importa máis, porque cada elo da cadea se puxo a proba cunha intervención distinta, e cada intervención ten límites.

A ferroptose nun parágrafo

Un fosfolípido de membrana cunha cola de ácido graxo poliinsaturado ten un punto feble: átomos de hidróxeno que son fáciles de arrancar. Cando un radical arranca un deles, o osíxeno únese ao lípido, fórmase un radical peroxilo lipídico e ese radical arranca un hidróxeno do seguinte lípido. A reacción propágase pola membrana a menos que algo a deteña.

O principal mecanismo de freo é un encima chamado GPX4, que utiliza glutatión para reducir os peróxidos lipídicos a alcohois lipídicos inocuos. Os estímulos de laboratorio atacan esta defensa en puntos definidos. A erastina bloquea a entrada de cistina a través do sistema xc-minus, o que deixa a célula sen cisteína para sintetizar glutatión. A sulfoximina de butionina bloquea directamente a síntese de glutatión. RSL3 inhibe a propia GPX4. Os tres deixan peróxidos sen eliminar, pero fano en pasos distintos, polo que un resultado cun estímulo non se pode xeneralizar automaticamente aos outros.

A ferroptose diferénciase da apoptose polas propiedades que a definen. Non hai unha cascada de caspases nin corpos apoptóticos. Os quelantes do ferro, como a deferoxamina, e os axentes que atrapan radicais, como a ferrostatina-1, suprímena; esta é a proba operativa que utilizan os investigadores para cualificar unha morte como ferroptótica e non simplemente necrótica. O panorama máis amplo das vías de morte celular regulada sitúa esta distinción en contexto, e a maneira en que as células xestionan o ferro lábil explica por que a quelación é un control tan decisivo.

Onde encaixan as mitocondrias e por que se discutía o seu papel

Os primeiros traballos indicaron que as células sen ADN mitocondrial tamén sofren ferroptose, o que suxeriu que as mitocondrias son opcionais. Traballos posteriores descubriron que reducir o número de mitocondrias ou bloquear a respiración pode suprimir a ferroptose causada pola privación de cisteína, pero non a causada pola inhibición directa de GPX4. Ambos os resultados poden ser certos se a contribución mitocondrial depende do estímulo, do tipo celular e do lugar onde se produce a peroxidación decisiva.

O estudo que serve de base a este artigo abordou a controversia cunha sonda específica dun compartimento. MitoCLox é unha versión dun indicador de peroxidación lipídica dirixida ás mitocondrias: cambia a súa fluorescencia cando atopa radicais peroxilo lipídicos dentro delas. Nos fibroblastos tratados con erastina, a oxidación da sonda mitocondrial apareceu en células aínda vivas antes da morte, e foi heteroxénea entre as células da poboación. Esa secuencia temporal importa. A peroxidación que precede á morte é unha posible causa. A peroxidación medida só en células mortas é un resto do dano. Unha guía complementaria sobre os ensaios de peroxidación lipídica e o que indica cada sonda explica por que a localización da sonda determina o significado dun sinal.

O mesmo patrón apareceu nun segundo modelo. Os fibroblastos dun paciente con neuropatía óptica hereditaria de Leber, que presentan unha mutación no complexo I e un estrés oxidativo basal máis elevado, morreron por ferroptose cando se esgotou o glutatión, mentres que os fibroblastos de control resistiron. De novo, a oxidación da sonda mitocondrial apareceu primeiro. Os detalles figuran no estudo con fibroblastos sobre a peroxidación lipídica mitocondrial na ferroptose.

Que cambiou o azul de metileno nestes experimentos

O azul de metileno é un transportador redox. A súa forma oxidada acepta electróns de reaccións ligadas ao NADH no complexo I, e a súa forma reducida dóaos ao citocromo c, que os transfire ao complexo IV. Isto crea unha vía alternativa parcial que evita o segmento da cadea onde os electróns adoitan escapar cara ao osíxeno e formar superóxido. Quen queira coñecer o percorrido completo debería comezar por como o azul de metileno transporta electróns a través das mitocondrias.

Nos fibroblastos pulmonares tratados con erastina, o azul de metileno a 250 nanomolar preservou a viabilidade nunha medición de supervivencia celular, ao igual que os antioxidantes dirixidos ás mitocondrias SkQ1 e MitoTEMPO. Os controis delimitan a conclusión. A ferrostatina-1, o alfa-tocoferol e a deferoxamina tamén protexeron as células, o que confirma que a morte era ferroptótica. O análogo de SkQ1 sen un grupo antioxidante non ofreceu protección, o que apunta á química redox e non á acumulación inespecífica. A protección diminuíu por riba de aproximadamente 200 nanomolar de SkQ1, en consonancia co comportamento prooxidante coñecido dos antioxidantes quinónicos a cargas máis altas. O azul de metileno presenta o mesmo comportamento dual segundo a dose: é protector a niveis nanomolares baixos nestas placas e pode xerar peróxido de hidróxeno mediante ciclos redox cando se aumenta a concentración ou se expón a luz intensa. Este tipo de contexto sobre a dose abórdase en especies reactivas do osíxeno nas mitocondrias.

Os experimentos con mitocondrias illadas separaron despois as fontes de ROS. En presenza de ferro ferroso, os substratos que achegaban electróns ao complexo I, xunto coa rotenona, estimularon a oxidación da sonda. A rotenona bloquea o fluxo despois do sitio da flavina, polo que os transportadores anteriores permanecen reducidos e deixan escapar electróns cara ao osíxeno desde a flavina orientada cara á matriz. Os substratos que achegaban electróns ao complexo III, xunto coa antimicina A, produciron abundante peróxido de hidróxeno, pero non impulsaron a peroxidación lipídica. O mesmo sinal global de ROS, distinta localización, distinto resultado. Tanto SkQ1 como o azul de metileno suprimiron a peroxidación impulsada polo complexo I sen suprimir a propia produción de peróxido de hidróxeno, o que sitúa a súa acción despois da formación de ROS, no paso da peroxidación lipídica.

A vertente da sobrecarga de ferro e a pista da lipofuscina

Un segundo estudo abordou a pregunta desde o lado do ferro. Os cardiomiocitos H9c2 expostos a citrato férrico amónico en concentracións submilimolares desenvolveron ROS mitocondriais, peroxidación lipídica mitocondrial e, despois, ferroptose, seguida da acumulación dun pigmento semellante á lipofuscina nun prazo de 24 horas. A lipofuscina é o residuo autofluorescente de lípidos e proteínas oxidados que contén ferro e se acumula coa idade; a súa rápida aparición aquí conecta a peroxidación aguda impulsada polo ferro cun marcador clásico do envellecemento. Tanto o azul de metileno en concentracións nanomolares como SkQ1 evitaron a peroxidación, a morte e a acumulación do pigmento. As mitocondrias cardíacas illadas confirmaron o patrón: a rotenona xunto co ferro ferroso impulsou a peroxidación e un sinal semellante ao do pigmento, e ambos os axentes bloqueárono. A secuencia completa descríbese no estudo de sobrecarga de ferro en cardiomiocitos H9c2. A vertente do pigmento desta historia encaixa con lipofuscina e marcadores de envellecemento celular.

Que non mostran os ensaios de supervivencia celular

Unha medición de viabilidade como CellTiterBlue indica cantas células dunha placa permanecen metabolicamente activas tras aplicar un estímulo xunto cun posible protector. Isto pon a proba un mecanismo nun sistema definido. Non é un resultado dun tratamento. Ningún destes experimentos administrou unha dose a un paciente, mediu un resultado relacionado cunha enfermidade nin estableceu unha xanela terapéutica nun organismo.

Hai que sinalar explicitamente catro límites. Primeiro, os tipos celulares son poucos: fibroblastos pulmonares transformados, fibroblastos cutáneos primarios que inclúen unha liña cunha enfermidade mitocondrial e unha liña de cardiomiocitos de rata, ademais de mitocondrias illadas de corazón de rata. A sensibilidade variou segundo a liña, e a liña LHON era especialmente vulnerable por deseño. Segundo, os estímulos son condicións extremas de laboratorio: bloqueo completo do transporte ou da síntese, e cargas de ferro ás que ningún tecido se vería exposto de forma aguda. Terceiro, a concentración non se traslada mediante unha multiplicación. Unha concentración nanomolar no medio de cultivo non é unha dose humana, e a distribución do azul de metileno, a súa redución á forma incolora no sangue e nos tecidos, a exposición á luz e o potencial de membrana son factores que se interpoñen entre unha placa e unha persoa. Cuarto, as sondas informan sobre o seu propio compartimento. A oxidación de MitoCLox mostra que se formaron radicais lipídicos mitocondriais; non mostra que a rotura da membrana plasmática, o probable evento final, se impedise directamente en lugar de evitarse mediante unha acción nun paso anterior.

Así que a conclusión rigorosa é esta: nestes modelos, as ROS procedentes do complexo I xunto co ferro impulsan unha peroxidación lipídica mitocondrial que precede á ferroptose, e o azul de metileno en concentracións baixas interrompe ese segmento. Calquera conclusión que vaia máis alá dese segmento require outros experimentos en animais e, despois, en persoas.