Azul de metileno e esclerose múltiple: que avaliou a investigación en animais

Se busca azul de metileno para a EM, atopará artigos que parecen responder á mesma pregunta. Non é así. Un artigo administrou azul de metileno a ratos enfermos como tratamento. O outro nunca tratou ningún animal con el. Empregou o azul de metileno como tinguidura azul en cortes finos da medula espiñal para que un patólogo puidese observar a mielina ao microscopio.

Esta é a idea central de todo o artigo. O colorante ten dúas funcións en bioloxía que non comparten nada salvo o frasco. Como candidato a fármaco, adminístrase a un animal vivo e a pregunta é se a enfermidade cambia. Como tinguidura, aplícase a tecido morto e fixado despois do experimento e a pregunta é que aspecto tiña o tecido. Se pasa por alto esa distinción, lerá unha sección de métodos de patoloxía como se fose un resultado de tratamento.

Que é a EAE, en termos sinxelos

A encefalomielite autoinmune experimental, habitualmente abreviada como EAE, é o modelo animal estándar para estudar aspectos da esclerose múltiple. Un investigador inmuniza un rato susceptible cun fragmento dunha proteína da mielina máis un adxuvante potente. O sistema inmunitario ataca entón o sistema nervioso central do propio animal. O rato desenvolve unha debilidade ascendente que resulta doada de puntuar nunha escala de 0 a 5, desde unha cola flácida ata a parálise das extremidades posteriores.

Esa facilidade de puntuación explica por que a EAE é popular e tamén por que pode levar a conclusións erróneas. A EM humana xorde espontaneamente, implica un conxunto de dianas máis amplo e menos definido, e produce síntomas ópticos, sensitivos, cognitivos, cerebelosos e motores, cunha evolución recorrente ou progresiva. A EAE reproduce determinados mecanismos, como a inflamación, a desmielinización e o dano axonal, en condicións controladas. Non reproduce a EM en miniatura. Os lectores que queiran coñecer o marco xeral poden revisar como se cre que actúa o azul de metileno a nivel celular antes de valorar calquera afirmación sobre unha enfermidade concreta.

Os dous artigos que se describen a continuación tamén empregaron antíxenos distintos para a EAE, algo que importa. O estudo de tratamento induciu a enfermidade con MOG35-55, un péptido curto da glicoproteína da mielina dos oligodendrocitos. O estudo de patoloxía induciu a enfermidade con MP4, unha fusión de segmentos da proteína básica da mielina e da proteína proteolipídica. A elección da cepa e do antíxeno cambia onde aparecen as lesións e como se comporta a inflamación, polo que os dous estudos non son dúas repeticións dun mesmo experimento.

O mapa: do modelo á pregunta e aos límites

Manteña esta táboa aberta. É a referencia orixinal deste artigo. Cada fila indica que pregunta clínica pode abordar o modelo, que se mediu realmente e onde remata a extrapolación.

Calquera persoa que queira comprobar o seguinte titular pode reutilizar as mesmas columnas coa axuda de como ler estudos preclínicos: pregunte pola especie e o antíxeno, a función do composto, as variables avaliadas e se o resultado describe a evolución da enfermidade ou unha instantánea do tecido.

O resultado do tratamento: que cambiou coa administración

O estudo de tratamento de 2016 no Journal of Neuroimmunology empregou ratos femia C57BL/6, de arredor de 8 a 10 semanas de idade, inmunizados con 250 microgramos de MOG35-55 por rato. Tras a indución, os animais con EAE asignáronse aleatoriamente a un grupo con azul de metileno ou a un grupo con EAE sen tratamento, e seguíronse as puntuacións clínicas ata aproximadamente o día 30.

As puntuacións clínicas foron significativamente inferiores nos ratos tratados ca nos controis con EAE desde o día 15 ata o día 30, cun P inferior a 0.01. A análise da medula espiñal apuntou na mesma dirección, con menos infiltración inflamatoria, menos desmielinización e menos perda axonal nos animais tratados.

O aspecto distintivo foi o conxunto de indicadores de sinalización. O tratamento aumentou a activación de AMPK e a expresión de SIRT1 e suprimiu a activación de NF-kB, un interruptor central da inflamación. No ámbito da inmunidade adaptativa, reduciu a resposta Th17 e reforzou a resposta Treg. A cadea proposta é, por tanto: azul de metileno, AMPK e SIRT1, menor sinalización de NF-kB, cambio desde as Th17 inflamatorias cara ás Treg reguladoras, menor dano tisular e puntuacións máis baixas.

Esa cadea é unha interpretación, non unha secuencia causal demostrada. O estudo mostra que o fármaco, os cambios na sinalización e a mellora da enfermidade avanzan xuntos. Non demostra que AMPK e SIRT1 expliquen todo o beneficio, e o texto indexado publicamente non especifica a dose exacta en miligramos por quilogramo, a vía, o día de inicio ou a duración coa claridade suficiente para reproducir a pauta só a partir do resumo. Considere sen verificar calquera cifra de dosificación sobre este artigo que apareza nunha páxina de vendas, salvo que cite os métodos do texto completo. O conxunto máis amplo de evidencias en humanos sobre o azul de metileno é onde se debe comprobar se este sinal inmunitario inicial chegou algunha vez a dar lugar a datos clínicos.

O resultado de patoloxía: que mostrou o tecido ao longo de seis meses

O estudo con MP4 de 2015 en PLoS ONE empregou ratos femia C57BL/6 inmunizados con 200 microgramos de MP4 en adxuvante completo de Freund, máis toxina pertúsica o día da inmunización e de novo 48 horas despois. Ningún animal recibiu azul de metileno como fármaco. Tras a fixación e a inclusión, tinguíronse con azul de metileno cortes transversais da medula espiñal dun micrómetro para a microscopía óptica, e empregouse a microscopía electrónica do tracto ventrolateral para obter máis detalle.

Tomáronse mostras de tecido en tres fases: no pico agudo, con 7 ratos; aos tres meses do inicio, con 5 ratos; e aos seis meses do inicio, con 10 ratos. As puntuacións clínicas medias nesas fases parecían case idénticas, próximas a 1.7–1.8 na escala de 0 a 5. O tecido contaba outra historia. O dano illado da mielina pasou de arredor de 569,000 fibras por milímetro cadrado no pico agudo a arredor de 1,496,000 aos seis meses, e a comparación entre a fase aguda e o longo prazo foi significativa, cun P igual a 0.027. O dano combinado da mielina e dos axóns aproximadamente duplicouse aos seis meses. As fibras en remielinización mantivéronse por debaixo do un por cento en todas as fases, un dato que modera as expectativas de reparación.

O dano axonal seguiu un patrón en forma de U: elevado no pico agudo, menor aos tres meses e máximo aos seis meses. Ademais, correlacionouse co inchazo mitocondrial e coa menor separación entre neurofilamentos. A avaliación realizouse sen coñecer a puntuación nin a fase, o que reforza a interpretación de que as puntuacións clínicas infrarrepresentaban o dano estrutural en curso.

Esa discordancia é a verdadeira contribución do estudo para quen le sobre EM. Unha puntuación de discapacidade estable non significaba que o tecido estivese estable. Tamén mostra por que este artigo non pode apoiar ningunha afirmación sobre o azul de metileno como tratamento da EM. Avaliou o tempo, non un tratamento.

Por que ningún dos estudos demostra un beneficio nos pacientes

Considere que cada artigo responde ben a unha pregunta concreta, pero non responde en absoluto á pregunta sobre os pacientes.

En primeiro lugar, a causa é distinta. A EAE provócase deliberadamente cun antíxeno definido e un adxuvante. A EM humana desenvólvese espontaneamente cun repertorio inmunitario máis amplo que inclúe células T, células B, inmunidade innata e glía residente. Un composto que modifica nun rato unha resposta orientada cara a MOG non ten por que modificar esa resposta humana máis ampla.

En segundo lugar, o fenotipo é distinto. A debilidade ascendente desde a cola ata as extremidades posteriores dun rato é un indicador cómodo. Condensa a heteroxeneidade da EM humana nun único número motor. Os fármacos modifican con frecuencia as puntuacións da EAE a curto prazo sen cambiar a evolución en humanos, polo que a EAE é unha ferramenta de cribado e de estudo de mecanismos, non unha clínica en miniatura.

En terceiro lugar, a exposición e o momento de administración seguen sen resolverse. A administración continua desde unha fase temperá nun experimento de 30 días en ratos non equivale ao uso oral crónico nunha persoa cunha enfermidade xa establecida, e ningún dos estudos mediu os niveis do fármaco no sistema nervioso. Sen ese vínculo, non hai unha ponte entre unha concentración nunha placa ou unha dose nun rato e unha pauta para humanos.

En cuarto lugar, os dous artigos non se replican entre si. Antíxenos distintos, preguntas distintas, variables avaliadas distintas e, nun caso, ningún tratamento. Citalos xuntos como dous estudos positivos de tratamento da EM é un erro de categoría.

Que significa isto para os lectores que sopesan as evidencias

Nestes artigos non hai ningún protocolo establecido de azul de metileno para a EM. O estudo de tratamento apoia continuar a investigación sobre AMPK, SIRT1, NF-kB e o equilibrio entre Th17 e Treg na EAE inducida por MOG. O estudo de patoloxía lembra que o dano tisular pode avanzar mentres as puntuacións parecen estables, e que o azul de metileno nunha sección de métodos ás veces significa un frasco de tinguidura e non un armario de medicamentos. Os lectores que sigan a investigación en curso sobre a esclerose múltiple deben ter presente esa distinción entre tinguidura e fármaco. As cuestións de seguridade, incluídos os riscos sanguíneos e de interaccións, deben tratarse nunha conversa cun profesional clínico, xunto cos datos xerais de seguridade do azul de metileno, antes de que ninguén actúe baseándose en titulares sobre resultados de laboratorio.

A conclusión cabe nunha frase. Un dos estudos citados administrou azul de metileno a ratos con EAE inducida por MOG e comunicou unha enfermidade máis leve cun cambio inmunitario antiinflamatorio, mentres que o outro estudo citado non administrou ningún tratamento e empregou o azul de metileno só para tinguir a medula espiñal mentres documentaba seis meses de acumulación de dano na mielina e nos axóns, polo que ambos, en conxunto, non demostran que o azul de metileno axude na EM humana.