Alternativas ao azul de metileno para microscopía: escolle segundo a tarefa

Para un frotis bacteriano simple, o violeta cristal pode substituír o azul de metileno cando o obxectivo é ver a forma das células. Para células vivas, unha alternativa mellor pode ser o contraste de fases sen ningunha tinguidura. A elección depende da observación que necesites realizar.

Supoñamos que dúas persoas examinan o mesmo cultivo bacteriano. Unha quere distinguir os bacilos das células redondas. A outra quere saber se un tratamento matou as bacterias. Unha tinguidura que lle ofrece á primeira persoa unha imaxe clara pode non darlle á segunda ningunha resposta útil.

Antes de escoller un substituto, completa esta frase: “Necesito observar ___ en ___, e as células deben / non teñen que permanecer vivas.” Esa frase define a función que debe cumprir a tinguidura.

Comeza pola mostra e pola pregunta

Primeiro decide se as células deben permanecer vivas e, despois, identifica a característica que necesitas observar:

• As células deben permanecer vivas: para observar o movemento ou a forma, considera o contraste de fases sen tinguidura ou DIC; para o ADN nuclear, considera Hoechst 33342 con fluorescencia; para a integridade da membrana, escolle un ensaio validado como SYTO 9 con ioduro de propidio.
• As células non teñen que permanecer vivas: para a morfoloxía bacteriana, considera unha tinguidura simple con violeta cristal ou unha tinguidura negativa con nigrosina; para a reacción de Gram, utiliza o método completo de tinguidura de Gram; para o ADN nuclear en células fixadas, considera a fluorescencia con DAPI.

Utiliza esta táboa para comparar as limitacións de cada opción. Trátase de eleccións de método, non de instrucións para intercambiar frascos dentro dun protocolo existente.

Para un frotis simple, substitúe o método con coidado

O violeta cristal é unha opción práctica cando a tarefa consiste en obter unha vista monocromática da morfoloxía bacteriana. O Bacteriological Analytical Manual da FDA recolle dúas formulacións de violeta cristal adecuadas para tinguidura simple. Utiliza unha formulación documentada e o seu método de preparación; o nome do colorante por si só non especifica un reactivo de traballo.

O violeta cristal tamén se utiliza na tinguidura de Gram, pero iso non converte unha tinguidura simple con violeta cristal nunha tinguidura de Gram. No protocolo de tinguidura de Gram da ASM, o resultado diferencial depende da acción secuencial do violeta cristal, o iodo, a decoloración e a contratinción. Omitir eses pasos cambia o que pode establecer a imaxe. Consulta tinguidura simple fronte á tinguidura de Gram para ver esta distinción.

A nigrosina ofrece outra forma de revelar os contornos: escurece o fondo mentres as células bacterianas permanecen comparativamente claras. Hai un detalle útil nas instrucións de Merck para a nigrosina que pode pasar desapercibido nunha lista xenérica de substitutos. A súa formulación de traballo especificada inclúe formaldehido. Polo tanto, non se pode inferir a compatibilidade con células vivas a partir das palabras «tinguidura negativa», aínda que as propias células parezan non estar tinguidas. Comproba a formulación completa e a preparación da mostra.

Para mostras vivas, considera cambiar a óptica

Se queres observar como se moven ou se dividen as células, introducir outro colorante pode complicar a observación. Como explica Nikon na súa guía sobre contraste en mostras transparentes, o contraste de fases e o contraste de interferencia diferencial, ou DIC, fan visibles as mostras mediante diferenzas nas súas propiedades ópticas. Poden revelar células vivas sen tinguir, sempre que o microscopio dispoña dos compoñentes necesarios.

Esta opción conserva unha preparación sen tinguidura, pero cambia a información dispoñible. Podes seguir un límite ou un movemento sen saber que molécula produciu o contraste. Se a pregunta se refire á localización molecular, escolle no seu lugar un método de marcaxe adecuado.

Para o ADN nuclear, a comparación de Invitrogen entre as tinguiduras DAPI e Hoechst distingue o uso habitual de DAPI con células fixadas do Hoechst 33342, máis permeable ás células e preferido para a marcaxe de células vivas. Ambos requiren equipamento de fluorescencia. Ningún deles é un substituto directo dunha tinguidura coloreada de campo claro.

Trata a exposición ao colorante e a iluminación como condicións experimentais. Compara preparacións tinguidas e sen tinguir cando o comportamento das células sexa a túa medición.

Unha célula vermella non é automaticamente unha célula morta

SYTO 9 e o ioduro de propidio adoitan empregarse en combinación para avaliar a integridade da membrana bacteriana. O manual de BacLight asocia as membranas intactas coa tinguidura verde e as membranas danadas coa tinguidura vermella. Esa interpretación debe validarse para a mostra concreta.

Un estudo de 2019 de Rosenberg e colaboradores ilustra o problema. En biofilmes de E. coli de 24 horas sobre vidro en solución salina tamponada con fosfato, arredor do 96% das células pareceron positivas para ioduro de propidio in situ. Porén, os autores estimaron que o 82% eran cultivables despois da recollida. As imaxes confocais mostraron células con interiores verdes baixo material tinguido de vermello, o que sinalaba os ácidos nucleicos extracelulares como responsables do sinal enganoso.

Estas porcentaxes describen medicións diferentes realizadas nas preparacións do estudo, non un factor de corrección universal. A lección útil é comprobar que xerou o sinal. Nun biofilme, un colorante de ácidos nucleicos pode detectar material fóra das células ademais do presente no interior de células danadas. Para chegar a unha conclusión sobre a viabilidade, os investigadores recomendan medicións complementarias, como o cultivo ou a actividade metabólica, recoñecendo ao mesmo tempo que cada unha ten limitacións.

Comproba que contén realmente a alternativa

Un método de tinguidura alternativo pode seguir contendo azul de metileno. Giemsa é un exemplo: Merck describe o seu produto como unha solución de Azure B-eosina-azul de metileno, destinada a aplicacións que inclúen frotis de sangue e medula ósea. Pode ser un método diferente para unha mostra diferente, pero non cumpre un requisito de exclusión do azul de metileno.

Se excluír un composto forma parte do experimento, comproba a identidade e a formulación do reactivo antes de comparar imaxes. A guía sobre azul de metilo, azul de metileno e colorantes con nomes semellantes aborda as diferenzas de nomenclatura.

Verifica a substitución antes de utilizar o resultado

Para un método novo, realiza unha pequena comparación empregando mostras representativas e un control adecuado. Mantén comparables os axustes do microscopio sempre que sexa posible. Rexistra a formulación do reactivo, a preparación da mostra, a exposición e as condicións de obtención de imaxes para que unha imaxe de mellor aspecto poida investigarse en lugar de simplemente preferirse.

Avalía o éxito en función da pregunta orixinal. Para a morfoloxía, comproba se os límites celulares e a disposición seguen sendo interpretables. Para a marcaxe nuclear, avalía a localización do sinal e o fondo. Para a viabilidade, esixe evidencias máis alá dunha separación de cores atractiva. A guía máis ampla sobre tinguidura con azul de metileno e aplicacións de laboratorio explica como se relacionan a observación e a preparación.

Escolle a alternativa que conserve a medición que necesitas. A cor é só unha das propiedades da imaxe resultante.