Le bleu de méthylène peut-il contourner le Complexe III mitochondrial ? Pourquoi les études divergent

Deux laboratoires ont cherché à savoir si le bleu de méthylène pouvait contourner un Complexe III mitochondrial bloqué. L’un a répondu non. L’autre a répondu oui. Tous deux disposaient de données.

La première étude, menée sur des mitochondries cérébrales de souris, a conclu que le colorant ne le pouvait pas. La deuxième, menée sur des mitochondries cérébrales provenant de trois espèces de rongeurs, a conclu qu’il le pouvait en partie. Une troisième étude, réalisée sur du foie de souris, est souvent citée à proximité, mais elle testait autre chose. Remettez-la à sa place et la moitié de la confusion disparaît.

Il n’existe pas de mécanisme universel à proclamer. Il existe trois expériences avec des bloqueurs, des doses et des mesures différents. Il faut d’abord lire les conditions. Les conclusions en découlent.

Ce que signifie « contourner » ici

Les électrons entrent dans la chaîne par le Complexe I (à partir du NADH) ou le Complexe II (à partir du succinate), passent par le Complexe III jusqu’au cytochrome c, puis par le Complexe IV jusqu’à l’oxygène. Le gradient ainsi créé est ce que la cellule utilise pour produire de l’ATP.

Affirmer un contournement signifie que le bleu de méthylène capte des électrons en amont d’un blocage et les restitue en aval. Le colorant oxydé accepte des électrons du NADH ou de composants précoces de la chaîne, devenant du leucométhylène bleu, puis la forme réduite les transmet au cytochrome c ou les réinjecte dans la chaîne. Si le transfert aboutit en aval du blocage, la respiration et le potentiel membranaire se rétablissent en partie. S’il aboutit au niveau du blocage ou en amont, rien ne se rétablit.

Un détail du Complexe III détermine une grande partie de ce débat. Le complexe fonctionne selon un cycle Q comportant deux sites d’inhibition. L’antimycine se lie au site Qi. Le myxothiazol se lie au site Qo. Une étude n’utilisant que l’un des deux n’a testé que la moitié du complexe.

Étude un : aucun contournement dans les mitochondries cérébrales de souris

Gureev et ses collègues ont utilisé des mitochondries du cortex de souris C57BL/6, isolées à la digitonine, analysées à 0.1 mg de protéines par ml. Les substrats couvraient trois régimes : pyruvate plus malate à 5 mM chacun, succinate à 10 mM avec glutamate à 2 mM, et L-proline à 10 mM. Les bloqueurs étaient la roténone à 1 micromolar (Complexe I) et l’antimycine à 1 microgram per ml (Complexe III). Les doses de colorant étaient de 0.5, 1 et 2 micromolar, avec 1 micromolar comme concentration principale. Les méthodes et les tracés figurent dans la communication de FEBS Letters.

Le contournement du Complexe I fonctionnait. La roténone a fait chuter la respiration stimulée par l’ADP d’environ 121 à environ 2 nmol per minute per mg, et 1 micromolar de colorant l’a rétablie à environ 21. Le potentiel membranaire s’est rétabli avec pyruvate plus malate et avec L-proline.

Le contournement du Complexe III ne fonctionnait pas. L’antimycine a fait chuter la respiration à environ 16, et le colorant ne l’a portée qu’à environ 20. Le potentiel membranaire ne s’est rétabli avec aucun substrat, pour des doses de colorant allant jusqu’à 5 micromolar. Les données sur les peroxydes allaient dans le même sens : le colorant seul augmentait l’émission de peroxyde à partir d’un taux basal proche de 76 pmol per minute per mg jusqu’à environ 1170, 1460 et 1945 aux trois doses, mais l’antimycine réduisait ce signal entraîné par le colorant d’environ 25, 88 et 96 percent respectivement. Si le colorant réduit réagissait directement avec l’oxygène, le blocage du Complexe III ne devrait pas supprimer le signal. Les auteurs en ont déduit que le colorant réduit est oxydé au site Qo du Complexe III, en amont du blocage par l’antimycine. Boucle courte, en mots : donneurs vers le colorant, colorant vers Qo, puis voie normale en aval. La roténone est contournée. L’antimycine ne l’est pas.

Étude deux : contournement partiel chez trois espèces, aux deux sites inhibiteurs

Svab et ses collègues ont élargi le protocole. Des mitochondries cérébrales de souris, de rats et de cobayes, isolées sur Percoll, ont été analysées à la même concentration de 0.1 mg per ml, avec pyruvate plus malate ou glutamate plus malate à 5 mM chacun. Ils ont utilisé deux bloqueurs du Complexe III : antimycine A à 0.3 micromolar et myxothiazol à 1 micromolar. Le colorant était utilisé à 2 micromolar dans la plupart des analyses, et à 0.5 dans les expériences sur le cytochrome c. Les trois espèces étudiées selon des protocoles comparables figurent dans l’article en libre accès.

Les deux blocages étaient partiellement contournés, chez les trois espèces. Dans les mitochondries de souris, l’antimycine supprimait la respiration et le colorant l’augmentait d’environ 60 percent, d’environ 37 à 59 nmol per minute per mg. Le myxothiazol la supprimait de 88 percent, jusqu’à environ 4.5, et le colorant l’augmentait d’un facteur cinq jusqu’à environ 23. Le potentiel membranaire se repolarisait partiellement sous chacun des inhibiteurs, mesuré avec deux colorants (safranine O et TMRM ratiométrique) afin d’exclure les artefacts optiques.

Cet article a également testé directement le transfert d’électrons, ce que la première étude n’avait jamais fait. Le cytochrome c acétylé exogène à 25 micromolar n’était pas réduit par les mitochondries énergisées, avec ou sans inhibiteurs, mais l’ajout du colorant provoquait sa réduction dans les deux cas. Dans un tampon dépourvu de cellules, le NADH plus le colorant réduisait le cytochrome c à une vitesse proportionnelle au NADH. Saut plus long, en mots : équivalents réducteurs vers le colorant, colorant directement vers le cytochrome c, Complexe IV vers l’oxygène. Cette voie évite entièrement le Complexe III, de sorte que les deux bloqueurs peuvent être contournés.

Deux mesures supplémentaires soutiennent cette interprétation. La fluorescence NAD(P)H diminuait lorsque le colorant était ajouté à des mitochondries traitées au myxothiazol, ce qui indique que les équivalents réducteurs s’écoulaient par la nouvelle voie. Et l’absorbance du colorant à 660 nm suivait chaque ajout successif, tandis que les surnageants après centrifugation montraient que le colorant oxydé s’enrichissait de plus de cent fois à l’intérieur des mitochondries énergisées, puis en ressortait lorsque le potentiel s’effondrait. L’économie des protons concorde également : contourner les étapes de pompage ne laisse qu’environ 2 protons par paire d’électrons au lieu de 10, de sorte qu’une consommation d’oxygène plus rapide accompagnée d’une repolarisation seulement partielle correspond précisément à ce qu’on attend d’un véritable contournement, et ne constitue pas un argument contre celui-ci.

La même préparation produisait des réponses qui rendent toute lecture superficielle trompeuse. Avec inhibiteur plus colorant, l’ADP réduisait la respiration au lieu de l’augmenter, et le blocage du transport la stimulait au lieu de la ralentir, tandis que le potentiel membranaire évoluait toujours dans les directions normales. La consommation d’oxygène seule est trompeuse dans ce système.

Étude trois : l’étude sur le foie qui testait les Complexes I et II, et non III

Lee et Boelsterli ont utilisé des mitochondries de foie de souris et des hépatocytes en culture lésés par l’efavirenz (Complexe I, IC50 proche de 30 micromolar) et l’hydrazine, le métabolite de l’isoniazide (Complexe II, IC50 proche de 30 micromolar). Le colorant à environ 30 micromolar rétablissait l’oxydation du NADH, le potentiel membranaire et l’ATP tout en réduisant les oxydants et la mort nécrotique. L’article de Redox Biology modélise ce phénomène comme un transport d’électrons par le colorant autour des Complexes I et II lésés.

Ce résultat constitue un contexte établi en amont, mais il ne dit rien sur le Complexe III, car rien n’y était bloqué à ce niveau. Il ne peut ni confirmer ni réfuter l’une ou l’autre des études cérébrales.

La matrice des conditions

Quatre raisons pour lesquelles les deux études sur le Complexe III peuvent être correctes dans leurs propres conditions

1. Le bloqueur n’était pas la même intervention. Antimycine seule à 1 microgram per ml contre antimycine à 0.3 micromolar plus un bloqueur distinct du site Qo. Une voie du colorant alimentant le site Qo échoue précisément là où une voie directe vers le cytochrome c réussit. Un seul site ne peut pas représenter les deux.

2. La dose de colorant et le calendrier différaient. Des concentrations principales de 1 contre 2 micromolar, dans un cycle redox dont l’absorption et la réduction directe du cytochrome c dépendent de la concentration et du temps. De faibles écarts de dose associés à des moments de mesure différents peuvent révéler différentes branches d’un même réseau.

3. Les préparations différaient. L’isolement à la digitonine, comparé à l’isolement sur gradient de Percoll, sélectionne des populations mitochondriales qui se chevauchent sans être identiques. La concentration protéique était identique à 0.1 mg per ml, de sorte que cette variable disparaît, mais pas les différences de sous-population ni d’intégrité. Et l’hypothèse d’un effet propre à l’espèce a été écartée : le second groupe a également reproduit son phénotype chez la souris.

4. L’état du substrat détermine ce que le colorant peut faire. Trois régimes de substrats contre des paires liées au NADH. L’apport de NADH et le potentiel membranaire déterminent ensemble la vitesse à laquelle le colorant est réduit et l’endroit où il se répartit, et une voie nécessitant du colorant réduit à proximité du cytochrome c oxydé dépend directement de ce choix.

Comment lire la prochaine affirmation de contournement

Demandez quel complexe a été bloqué, avec quel inhibiteur, à quel site et à quelle dose. Demandez la concentration du colorant et à quel moment la mesure a été effectuée. Demandez le tissu, l’espèce, la méthode d’isolement, la concentration protéique et le substrat. Et demandez si le potentiel, la respiration, l’état redox et une analyse directe du transfert concordent, car la consommation d’oxygène seule a indiqué la mauvaise direction à plusieurs reprises ici.

Le résumé précis reste valable. Le contournement du Complexe I par le colorant fait consensus. Pour le Complexe III, des mitochondries de souris avec antimycine à 1 microgram per ml et colorant à 1 micromolar ne montrent aucun contournement fonctionnel, tandis que trois espèces avec antimycine à 0.3 micromolar ou myxothiazol à 1 micromolar et colorant à 2 micromolar montrent un contournement partiel avec transfert direct du colorant vers le cytochrome c. Ces phrases peuvent coexister. Toute affirmation plus générale relève de l’extrapolation.

Pour replacer cette affirmation contestée dans une chimie non contestée, voir aussi : comment le bleu de méthylène déplace les électrons pour le relais, les expériences de contournement du Complexe I pour le cas établi en amont, les mesures du potentiel membranaire et leurs artefacts pour comprendre pourquoi deux colorants étaient nécessaires, ainsi que la manipulation en laboratoire des cycles redox pour les pièges liés au dosage et au calendrier.