Alternatives au bleu de méthylène pour la microscopie : choisir selon la tâche

Pour un simple frottis bactérien, le cristal violet peut remplacer le bleu de méthylène lorsque l’objectif est d’observer la forme des cellules. Pour des cellules vivantes, une meilleure alternative peut être le contraste de phase sans aucune coloration. Le choix dépend de l’observation que vous devez effectuer.

Supposons que deux personnes examinent la même culture bactérienne. L’une veut distinguer les bacilles des cellules rondes. L’autre veut savoir si un traitement a tué les bactéries. Une coloration qui fournit à la première personne une image claire peut ne fournir à la seconde aucune réponse exploitable.

Avant de choisir un substitut, complétez cette phrase : « Je dois observer ___ dans ___, et les cellules doivent / ne doivent pas rester vivantes. » Cette phrase définit la fonction que la coloration doit remplir.

Commencez par l’échantillon et la question

Déterminez d’abord si les cellules doivent rester vivantes, puis identifiez la caractéristique que vous devez observer :

• Les cellules doivent rester vivantes : pour le mouvement ou la forme, envisagez le contraste de phase sans coloration ou le DIC ; pour l’ADN nucléaire, envisagez Hoechst 33342 avec fluorescence ; pour l’intégrité membranaire, choisissez un test validé tel que SYTO 9 avec de l’iodure de propidium.
• Les cellules ne doivent pas nécessairement rester vivantes : pour la morphologie bactérienne, envisagez une coloration simple au cristal violet ou une coloration négative à la nigrosine ; pour la réaction de Gram, utilisez la méthode complète de coloration de Gram ; pour l’ADN nucléaire dans des cellules fixées, envisagez la fluorescence DAPI. Utilisez ce tableau pour comparer les limites de chaque branche. Il s’agit de choix de méthodes, et non d’instructions visant à remplacer un flacon par un autre dans un protocole existant.

Pour un frottis simple, remplacez la méthode avec précaution

Le cristal violet est une option pratique lorsque la tâche consiste à obtenir une vue monochrome de la morphologie bactérienne. Le Bacteriological Analytical Manual de la FDA répertorie deux formulations de cristal violet adaptées à une coloration simple. Utilisez une formulation documentée et sa méthode de préparation ; le seul nom du colorant ne suffit pas à définir un réactif prêt à l’emploi.

Le cristal violet est également utilisé dans la coloration de Gram, mais cela ne signifie pas qu’une coloration simple au cristal violet constitue une coloration de Gram. Dans le protocole de coloration de Gram de l’ASM, le résultat différentiel dépend de l’action séquentielle du cristal violet, de l’iode, de la décoloration et de la contre-coloration. L’omission de ces étapes modifie ce que l’image permet d’établir. Consultez coloration simple et coloration de Gram pour comprendre cette distinction.

La nigrosine offre une autre manière de révéler les contours : elle assombrit l’arrière-plan tandis que les cellules bactériennes restent relativement claires. Les instructions de Merck pour la nigrosine contiennent un détail utile qu’une liste générique de substituts peut omettre. La formulation de travail spécifiée contient du formaldéhyde. Vous ne pouvez donc pas déduire la compatibilité avec des cellules vivantes à partir des seuls termes « coloration négative », même si les cellules elles-mêmes semblent non colorées. Vérifiez la formulation complète et la préparation de l’échantillon.

Pour les échantillons vivants, envisagez de modifier l’optique

Si vous souhaitez observer des cellules se déplacer ou se diviser, l’ajout d’un autre colorant peut compliquer l’observation. Comme l’explique Nikon dans son guide sur le contraste des échantillons transparents, le contraste de phase et le contraste interférentiel différentiel, ou DIC, rendent les échantillons visibles grâce aux différences de leurs propriétés optiques. Ils peuvent révéler des cellules vivantes non colorées, à condition que le microscope dispose des composants nécessaires.

Ce choix permet de conserver une préparation non colorée, mais il modifie les informations disponibles. Vous pouvez suivre une limite cellulaire ou un mouvement sans savoir quelle molécule a produit le contraste. Si la question porte sur la localisation moléculaire, sélectionnez plutôt une méthode de marquage appropriée.

Pour l’ADN nucléaire, la comparaison des colorations DAPI et Hoechst proposée par Invitrogen distingue l’utilisation courante de DAPI avec des cellules fixées de Hoechst 33342, plus perméable aux cellules et privilégié pour le marquage des cellules vivantes. Les deux nécessitent un équipement de fluorescence. Aucun des deux ne remplace directement une coloration colorée en champ clair.

Considérez l’exposition au colorant et l’éclairage comme des conditions expérimentales. Comparez des préparations colorées et non colorées lorsque le comportement des cellules constitue votre mesure.

Une cellule rouge n’est pas automatiquement une cellule morte

SYTO 9 et l’iodure de propidium sont souvent utilisés ensemble pour évaluer l’intégrité de la membrane bactérienne. Le manuel BacLight associe les membranes intactes à une coloration verte et les membranes endommagées à une coloration rouge. Cette interprétation doit être validée pour l’échantillon concerné.

Une étude de 2019 menée par Rosenberg et ses collègues illustre le problème. Dans des biofilms d’E. coli de 24 heures sur verre dans une solution saline tamponnée au phosphate, environ 96% des cellules semblaient positives à l’iodure de propidium in situ. Pourtant, les auteurs ont estimé que 82% étaient cultivables après prélèvement. Les images confocales montraient des cellules dont l’intérieur était vert sous du matériel coloré en rouge, ce qui impliquait les acides nucléiques extracellulaires dans le signal trompeur.

Ces pourcentages décrivent des mesures différentes effectuées sur les préparations de l’étude, et non un facteur de correction universel. La leçon utile consiste à vérifier ce qui a généré le signal. Dans un biofilm, un colorant des acides nucléiques peut détecter du matériel situé à l’extérieur des cellules ainsi qu’à l’intérieur de cellules endommagées. Pour tirer une conclusion sur la viabilité, les chercheurs recommandent des mesures complémentaires, telles que la culture ou l’activité métabolique, tout en reconnaissant que chacune présente des limites.

Vérifiez ce que contient réellement l’alternative

Une autre méthode de coloration peut malgré tout contenir du bleu de méthylène. Giemsa en est un exemple : Merck décrit son produit comme une solution d’azur-éosine-bleu de méthylène, destinée notamment à des applications telles que les frottis sanguins et de moelle osseuse. Il peut s’agir d’une méthode différente pour un échantillon différent, mais elle ne satisfait pas à une exigence visant à exclure le bleu de méthylène.

Si l’exclusion d’un composé fait partie de l’expérience, vérifiez l’identité et la formulation du réactif avant de comparer les images. Le guide sur le bleu de méthyle, le bleu de méthylène et les colorants aux noms similaires traite de ces différences de nomenclature.

Vérifiez la substitution avant d’utiliser le résultat

Pour une nouvelle méthode, effectuez une comparaison à petite échelle à l’aide d’échantillons représentatifs et d’un contrôle approprié. Maintenez autant que possible des réglages de microscope comparables. Consignez la formulation du réactif, la préparation de l’échantillon, l’exposition et les conditions d’imagerie afin qu’une image visuellement meilleure puisse être examinée plutôt que simplement préférée.

Évaluez la réussite par rapport à la question initiale. Pour la morphologie, vérifiez si les limites cellulaires et leur disposition restent interprétables. Pour le marquage nucléaire, évaluez la localisation du signal et le bruit de fond. Pour la viabilité, exigez des éléments probants allant au-delà d’une séparation visuelle attrayante des couleurs. Le guide plus général sur la coloration au bleu de méthylène et ses applications en laboratoire explique comment l’observation et la préparation s’articulent.

Choisissez l’alternative qui préserve la mesure dont vous avez besoin. La couleur n’est qu’une propriété de l’image obtenue.