مقاله
متیلن بلو چگونه وارد سلول‌ها می‌شود: کاهش، اکسایش مجدد و توزیع در غشا
جذب متیلن بلو را در ظرفی حاوی سلول‌های اندوتلیال تماشا کنید؛ برداشت آشکار از آن، همان برداشت اشتباه است. محیط کشت رنگ آبی خود را از دست می‌دهد و دانه‌های آبی در سلول‌ها ظاهر می‌شوند؛ پس لابد رنگ در قالب مولکول آبی از غشا عبور کرده است. اما آزمایش‌ها چیز دیگری می‌گویند. شکل آبی به‌سختی عبور می‌کند. آنچه عبور می‌کند شکل بی‌رنگ است، و رنگ آبی‌ای که درون سلول می‌بینید، پس از ورود در همان‌جا ساخته می‌شود.
این وارونگی مهم است، زیرا تعیین می‌کند رنگ‌گیری چه چیزی را می‌تواند و چه چیزی را نمی‌تواند به شما بگوید. دانه‌های آبی نشان‌دهندهٔ رنگ اکسیدشده‌ای هستند که دوباره اکسید شده و در اندامک‌ها به دام افتاده است. آن‌ها نه کل رنگ موجود در سلول را نشان می‌دهند، نه ذخیرهٔ کاهش‌یافته را، و نه اثر زیستی را اندازه می‌گیرند. برای درک دلیل آن، سه مرحله را دنبال کنید: کاهش در سطح، انتشار شکل کاهش‌یافته، و اکسایش مجدد و به‌دام‌افتادن درون سلول.
دو شکل مانند دو مولکول متفاوت رفتار می‌کنند
متیلن بلوی اکسیدشده یک سامانهٔ حلقه‌ای مسطح با بار مثبت است. در آب حل می‌شود، نور را در محدودهٔ حدود 600 تا 700 nanometers به‌شدت جذب می‌کند و آبی به نظر می‌رسد. نکتهٔ اصلی همان بار الکتریکی است. یک مولکول باردار و آب‌دوست به‌سادگی از غشای لیپیدی عبور نمی‌کند؛ بنابراین تعبیر دقیق در منابع علمی «نسبتاً نفوذناپذیر از غشا» است، نه «نفوذناپذیر».
متیلن بلوی کاهش‌یافته، که لوکومتیلن بلو نام دارد، بی‌رنگ، بدون بار و محلول در چربی است. با حذف بار، غشا دیگر نقش دیوار را ندارد. مولکول کاهش‌یافته به‌راحتی از غشا منتشر می‌شود و پس از ورود به بخشی با شرایط اکسیدکننده‌تر، می‌تواند دوباره الکترون از دست بدهد و به شکل آبی، باردار و به‌دام‌افتاده بازگردد. بنابراین شیمی اکسایش‌کاهش این رنگ سازوکار انتقال آن نیز هست. با تغییر تعداد الکترون‌ها، نفوذپذیری را تغییر می‌دهید.
الکترون‌های مرحلهٔ نخست از خود سلول می‌آیند. سلول‌های پستانداران انتقال الکترون را در عرض غشای پلاسمایی انجام می‌دهند و معادل‌های کاهنده را از دهنده‌های درون‌سلولی به پذیرنده‌های سطح سلول منتقل می‌کنند. این فعالیت انتقالی در عرض غشای پلاسمایی، عملکردی طبیعی است که در بیشتر انواع سلول یافت می‌شود. ردوکتاز سطحی اندوتلیال که رنگ‌های تیازینی را کاهش می‌دهد، از یک جهت گویا مانند دیگر ردوکتازها رفتار می‌کند: در حضور سیانید و آزید، در دوزهایی که مراحل بعدی را متوقف می‌کنند، همچنان به کار خود ادامه می‌دهد. این جدایی، محور کل ماجراست.
ابتدا مدل توزیع میان فازها مطرح شد و نزدیک بود جذب را توضیح دهد
در سال 1929، ماریان اروین در مؤسسهٔ راکفلر پرسش ساده‌تری مطرح کرد. شاید ورود رنگ فقط حاصل توزیع آن میان آب و لایه‌های چرب سلول باشد و بتوان در آزمایشگاه از یک لایهٔ کلروفرم به‌جای آن لایه‌های چرب استفاده کرد. او در مطالعات طیف‌سنجی نوری دربارهٔ نفوذ، محلول‌های آبی رنگ را با کلروفرم تکان داد و مقدار منتقل‌شده به فاز آلی را با مقداری که وارد سلول‌های زندهٔ جلبک می‌شد مقایسه کرد.
دو یافتهٔ آن کار هنوز شایستهٔ توجه‌اند. نخست، محلول‌های تجاری متیلن بلو حاوی تری‌متیل تیونین بودند که اکنون Azure B نامیده می‌شود. این ناخالصی سریع‌تر از خود متیلن بلو نفوذ می‌کرد، به‌ویژه در pH قلیایی که شکل باز آزادِ محلول در چربی غالب است. بخشی از ورود ظاهری متیلن بلو، در واقع ورود انتخابی Azure B بود. دوم، pH با تعیین حالت یونش، نتیجه را تعیین می‌کرد و سلول‌های آسیب‌دیده رنگ بسیار بیشتری نسبت به سلول‌های سالم می‌پذیرفتند. ضرایب توزیع و وضعیت بار الکتریکی تعیین می‌کردند سامانهٔ مصنوعی و سلول زنده هرکدام چه چیزی را جذب کنند؛ شباهت میان این دو نیز از ایدهٔ وجود لایه‌های غیرآبی در مرز سلول پشتیبانی می‌کرد.
این مدل دربارهٔ لیپیدها و یونش پیشرو بود، اما نمی‌توانست میان رنگی که بدون تغییر شیمیایی میان فازها توزیع می‌شود و رنگی که در سطح از نظر شیمیایی تغییر می‌کند، در شکل دیگری عبور می‌کند و درون سلول دوباره به شکل اولیه بازمی‌گردد، تمایز بگذارد. این تمایز به آزمایش دیگری نیاز داشت که هفتاد سال بعد، در اندوتلیوم ریه انجام شد.
کاهش در بیرون، به‌دام‌افتادن در درون
مرکر و همکارانش با سلول‌های اندوتلیال کشت‌شدهٔ شریان ریوی گاو کار کردند و توالی سه‌مرحله‌ای زیر را پیشنهاد دادند: رنگ اکسیدشده در سطح سلول به شکل بی‌رنگ و چربی‌دوست خود کاهش می‌یابد، شکل کاهش‌یافته به درون منتشر می‌شود، و اکسایش مجدد درون‌سلولی شکل اکسیدشدهٔ نفوذناپذیر از غشا را بازسازی می‌کند که سپس تجمع می‌یابد. آن‌ها در مطالعهٔ جذب تیازین در سلول‌های اندوتلیال این توالی را با تلاش برای مختل‌کردن آن در نقاط مشخص آزمودند.
ابزار نخست فری‌سیانید بود؛ یک پذیرندهٔ الکترون که نمی‌تواند وارد سلول شود. هنگامی که آنزیم‌های سطحی، رنگ آبی را در خارج سلول به شکل بی‌رنگ آن کاهش می‌دهند، فری‌سیانید می‌تواند آن الکترون‌ها را پس بگیرد و پیش از آنکه رنگ از غشا عبور کند، شکل آبی را در محیط بازسازی کند. تا زمانی که فری‌سیانید به مقدار اضافی وجود داشت، یعنی 10 micromolar رنگ در برابر 50 تا 500 micromolar فری‌سیانید، جذب رنگ تقریباً متوقف می‌شد؛ تنها پس از مصرف‌شدن فری‌سیانید بود که جذب با سرعت طبیعی خود از سر گرفته می‌شد. سینتیک نیز همین موضوع را از راه دیگری نشان می‌داد. فری‌سیانید با سرعتی تقریباً ثابت ناپدید می‌شد؛ این رفتار با شار پایدار کاهش سطحی که یک واسطهٔ قابل بازیافت را تغذیه می‌کرد سازگار بود. در مقابل، رنگ خارج‌سلولی با کاهش ذخیره‌اش به‌صورت نمایی ناپدید می‌شد. وجود یک شار ثابت در کنار ذخیره‌ای رو به کاهش یعنی سیگنال فری‌سیانید، کاهش پیوسته را نشان می‌دهد، نه خروج مولکول‌های رنگ از محلول را.
ابزار دوم، مرحلهٔ عبور را به‌کلی حذف کرد. گروه پژوهشی تولوئیدین بلو O، یکی از خویشاوندان نزدیک تیازینی، را به زنجیره‌ای بزرگ از پلی‌آکریل‌آمید متصل کرد که آن‌قدر بزرگ بود که در هیچ‌یک از دو حالت اکسایش نمی‌توانست وارد سلول شود. سلول‌ها همچنان رنگ متصل به زنجیره را کاهش می‌دادند. پس کاهش به دسترسی درون‌سلولی نیاز ندارد. دستگاه انجام‌دهندهٔ این فرایند یا در سطح قرار دارد یا از نظر الکتریکی با آن در ارتباط است.
سپس جدایی‌ای آشکار شد که عنوان مقاله از آن گرفته شده است. سیانید و آزید در غلظت 2 millimolar تجمع رنگ را به‌شدت مهار کردند و زیر میکروسکوپ، اجسام آبی تیره و بنفشی که معمولاً پیرامون هسته قرار می‌گیرند، تقریباً ناپدید شدند. بااین‌حال، هیچ‌یک از این دو مهارکننده سرعت کاهش خارج‌سلولی را کم نکرد: چرخهٔ فری‌سیانید بدون افت ادامه داشت و پلیمر نفوذناپذیر همچنان کاهش می‌یافت. مانع در مراحل پایین‌دست بود. سیانید و آزید، اکسایش مجدد و محبوس‌شدن درون‌سلولی را متوقف می‌کردند، نه کاهش سطحی را. آزمون‌های کنترلی زنده‌مانی نیز این برداشت را تأیید کردند، زیرا سلول‌ها در طول این تیمارها آنزیم نشانگر سیتوزولی خود، لاکتات دهیدروژناز، را حفظ کردند؛ بنابراین ازبین‌رفتن جذب صرفاً ناشی از مسمومیت یا پارگی غشا نبود.
یکی از هشدارهای مقاله همچنان پابرجاست. اجسام آبی پیرامون هسته قرار داشتند، نه درون آن؛ این مشاهده با اکسایش درون اندامک‌های زیرسلولی سازگار بود، اما مطالعه مشخص نکرد این اندامک‌ها کدام‌اند. الگوهای مشابه در انواع دیگر سلول، با شواهدی ضعیف لیزوزومی نامیده شده بودند. به‌دام‌افتادن را اثبات‌شده بدانید، اما محل آن را هنوز قطعی ندانید. خوانندگانی که مسیر بعدی الکترون‌ها را دنبال می‌کنند، می‌توانند به انتقال الکترون میتوکندریایی و تنظیم اکسایش‌کاهش و تصویر گسترده‌تر جذب و توزیع برحسب مسیر ورود مراجعه کنند.
رنگ‌گیری، میزان مواجهه نیست
مطالعه‌ای سوم نشان می‌دهد وقتی این منطق جذب با یک شاخص زیستی روبه‌رو می‌شود، چه رخ می‌دهد. اسکات و همکارانش دریافتند متیل بتا سیکلودکسترین، یک مولکول قندی حلقه‌ای، مستقیماً به متیلن بلو متصل می‌شود؛ ثابت اتصال برای کمپلکس دربرگیری حدود 310 per molar بود، در برابر حدود 5846 per molar برای دیمری‌شدن رنگ. در فیبروبلاست‌های L929، این اتصال هم رنگ‌گیری سلول و هم تحریک جذب گلوکز را مسدود کرد: پیش‌انکوباسیون با سیکلودکسترین از رنگ‌گیری آبی جلوگیری کرد و افزودن آن پس از رنگ‌گیری، رنگ‌زدایی را سرعت بخشید. هم‌زمان با خروج سیگنال نوری آبی از سلول‌ها، افزایش فعالیت انتقال گلوکز نیز با هم‌خوانی نزدیک فروکش کرد.
نویسندگان این همبستگی را مؤید برهم‌کنش مستقیم میان رنگ و یک پروتئین در مسیر فعال‌سازی ناقل گلوکز دانستند، نه یک سازوکار تنش اکسایشی پایدار. این استنباط معقول است، اما دامنهٔ محدودی دارد. آزمایش، پروتئین را مشخص نمی‌کند، اتصال به خود ناقل را نشان نمی‌دهد و همبستگی میان رنگ‌زدایی و ازبین‌رفتن اثر نمی‌تواند همهٔ مسیرهای با واسطهٔ اکسایش‌کاهش را رد کند.
درس ماندگار این یافته‌ها به اندازه‌گیری مربوط است. رنگ‌گیری نوری، رنگ قابل‌مشاهده، اکسیدشده و مرتبط با سلول را نشان می‌دهد. ذخیرهٔ کاهش‌یافتهٔ بی‌رنگ کاملاً از دید آن پنهان می‌ماند؛ بنابراین یک سلول کم‌رنگ همچنان می‌تواند معادل‌های رنگ را در خود داشته باشد، و سلولی با رنگ‌گیری شدید، رنگ اکسیدشدهٔ به‌دام‌افتاده را نشان می‌دهد، نه کل میزان مواجههٔ بافتی یا اندازهٔ اثر را. همین احتیاط در مقیاس بزرگ‌تر نیز برقرار است: مقایسهٔ رنگ‌گیری میان انواع سلول، یا تلقی یک برش بافتی تیره به‌عنوان اثبات مواجههٔ بیشتر، همان خطای اولیهٔ مشاهدهٔ ظرف کشت را تکرار می‌کند. جذب، چرخه‌ای از کاهش، انتشار و اکسایش مجدد است و هر تصویر لحظه‌ای از شکل آبی فقط یک بخش از آن را نشان می‌دهد. پیامدهای عملی برای رنگ‌آمیزی و کار با رنگ در آزمایشگاه و برای تفسیر ادعاهای مربوط به دوز و مواجهه، مستقیماً از همین نکته ناشی می‌شوند.