Metileno-urdina zeluletan nola sartzen den: erredukzioa, berroxidazioa, barneratzea

Zelula endotelialez osatutako kultibo-plaka batean metileno-urdina nola barneratzen den behatuz gero, ageriko interpretazioa okerra ere bada. Medioak kolore urdina galtzen du, zelulek pikor urdinak hartzen dituzte; beraz, tindagaiak molekula urdin gisa zeharkatu behar izan du mintza. Esperimentuek kontrakoa diote. Forma urdinak ia ez du mintza zeharkatzen. Zeharkatzen duena forma kolorgea da, eta barruan ikusten den urdina barruan sortzen da, sartu ondoren.

Ikuspegi-aldaketa hori garrantzitsua da, tindaketak zer esan dezakeen eta zer ez zehazten duelako. Pikor urdinek organuluetan berroxidatu eta harrapatuta geratutako tindagai oxidatuaren berri ematen dute. Ez dute adierazten zelulan dagoen tindagai guztia, ez dute forma erreduzituaren multzoaren berri ematen, eta ez dute efektu biologikoa neurtzen. Zergatia ulertzeko, jarraitu hiru urratsei: gainazaleko erredukzioa, forma erreduzituaren difusioa, eta barruko berroxidazioa eta harrapatzea.

Bi formek molekula desberdinen antzera jokatzen dute

Metileno-urdin oxidatua karga positiboa duen eraztun-sistema laua da. Uretan disolbatzen da, argia indarrez xurgatzen du 600 eta 700 nanometro inguruan, eta urdina dirudi. Karga da gakoa. Kargadun molekula hidrofilo batek ez du mintz lipidikoa erraz zeharkatzen; horregatik, literaturan erabiltzen den formulazio zehatza mintzarekiko nahiko iragazgaitza da, ez erabat iragazgaitza.

Metileno-urdin erreduzitua, leukometileno-urdina deitua, kolorgea da, ez du kargarik eta gantzetan disolbagarria da. Karga kenduz gero, mintzak horma izateari uzten dio. Molekula erreduzitua erraz barreiatzen da mintzean zehar, eta konpartimentu oxidatzaileago batean sartu ondoren, elektroiak berriz gal ditzake eta forma urdin, kargadun eta harrapatura itzul daiteke. Beraz, tindagaiaren erredox-kimika haren garraio-mekanismoa ere bada. Elektroi kopurua aldatzean, iragazkortasuna ere aldatzen da.

Lehen urratseko elektroiak zelulatik bertatik datoz. Ugaztunen zelulek elektroiak garraiatzen dituzte mintz plasmatikoan zehar, zelula barruko emaileetatik gainazaleko hartzaileetara baliokide erreduzitzaileak eramanez. Mintz plasmatikoan zeharreko jarduera hori zelularen funtzio normala da, zelula mota gehienetan aurkitzen dena. Tiazina-tindagaiak prozesatzen dituen gainazal endotelialeko erreduktasak beste erreduktasa batzuen antzera jokatzen du alderdi adierazgarri batean: lanean jarraitzen du zianuroa eta azida daudenean, ondorengo urratsak geldiarazten dituzten dosietan ere. Bereizketa hori da azalpen osoaren giltzarria.

Banaketa izan zen lehen azalpena, eta ia argitu zuen barneratzea

1929an, Rockefeller Institutuko Marian Irwinek galdera sinpleago bat egin zuen. Agian, tindagaiaren sarrera uraren eta zelularen gantz-geruzen arteko banaketa besterik ez da, eta kloroformo-geruza batek gantz-geruza horiek ordezka ditzake laborategian. Haren sarkortasunari buruzko azterketa espektrofotometrikoetan, tindagaien ur-disoluzioak kloroformoarekin astindu zituen, eta fase organikora igarotzen zena alga bizien zeluletan sartzen zenarekin alderatu zuen.

Lan hartako bi aurkikuntzak oraindik ere arreta merezi dute. Lehenik, metileno-urdinaren disoluzio komertzialek trimetiltionina zuten, gaur egun azure B deitua, eta ezpurutasun hori metileno-urdina bera baino azkarrago sartzen zen, bereziki pH alkalinoan, lipidoetan disolbagarria den base librearen forma nagusitzen denean. Metileno-urdinaren sarrera zirudienaren zati bat, berez, azure B-ren sarrera selektiboa zen. Bigarrenik, pH-ak emaitza zehazten zuen ionizazio-egoera zehaztuz, eta kaltetutako zelulek zelula osasuntsuek baino askoz tindagai gehiago sartzen uzten zuten. Banaketa-koefizienteek eta karga-egoerak arautzen zuten sistema artifizialak eta zelula biziak zer xurgatzen zuten, eta bien arteko antzekotasunak zelularen mugan urezkoak ez diren geruzak egotearen ideia babesten zuen.

Ereduak aurrea hartu zien lipidoen eta ionizazioaren garrantziari, baina ezin zuen bereizi bere horretan banatzen den tindagai batetik gainazalean kimikoki eraldatu, beste forma batean zeharkatu eta barruan jatorrizko formara itzultzen den tindagaia. Bereizketa horretarako beste esperimentu bat behar zen, eta hirurogeita hamar urte geroago iritsi zen, biriketako endotelioan.

Erredukzioa kanpoan, harrapatzea barruan

Merkerrek eta lankideek kultiboan hazitako behien birika-arterietako zelula endotelialekin lan egin zuten, eta hiru urratseko sekuentzia proposatu zuten: tindagai oxidatua zelularen gainazalean erreduzitzen da bere forma kolorge lipofilora, forma erreduzitua barrura barreiatzen da, eta zelula barruko berroxidazioak mintza zeharkatu ezin duen forma oxidatua birsortzen du; forma hori metatu egiten da. Ondoren, endotelioak tiazinak barneratzeari buruzko azterketan, sekuentzia probatu zuten, puntu jakin batzuetan eteten saiatuz.

Lehen tresna ferrizianuroa izan zen, zelulan sartu ezin den elektroi-hartzailea. Gainazaleko entzimek tindagai urdina zelulatik kanpo forma kolorgabera erreduzitzen dutenean, ferrizianuroak elektroi horiek berreskura ditzake, eta tindagai urdina medioan birsortu, mintza zeharkatu aurretik. Ferrizianuroa soberan zegoen bitartean (10 mikromolar tindagai eta 50 eta 500 mikromolar arteko ferrizianuroa), tindagaiaren barneratzea ia erabat gelditu zen, eta ferrizianuroa kontsumitu ondoren bakarrik hasi zen berriz ohiko abiaduran. Zinetikak gauza bera erakutsi zuen beste modu batean. Ferrizianuroa gutxi gorabehera abiadura konstantean desagertzen zen; hori bat zetorren bitartekari birziklagarri bat elikatzen zuen gainazaleko erredukzio-fluxu egonkor batekin. Zelulaz kanpoko tindagaia, aldiz, esponentzialki desagertzen zen, haren erreserba agortu ahala. Fluxu konstante batek eta agortzen ari den erreserba batek adierazten dute ferrizianuroaren seinaleak etengabeko erredukzioaren berri ematen duela, ez disoluziotik ateratzen diren tindagai-molekulena.

Bigarren tresnak mintza zeharkatzeko urratsa erabat ezabatu zuen. Taldeak toluidina-urdin O, tiazinaren gertuko ahaide bat, poliakrilamida-kate handi bati lotu zion; kate hori handiegia zen zelulan sartzeko, edozein oxidazio-egoeratan. Zelulek tindagai lotua erreduzitzen jarraitu zuten. Beraz, erredukziorako ez da zelula barrura sartzerik behar. Makineria gainazalean dago agerian, edo hari elektrikoki akoplatuta.

Ondoren etorri zen artikuluari izenburua ematen dion bereizketa. Zianuroak eta azidak, 2 milimolarreko kontzentrazioan, tindagaiaren metaketa nabarmen murriztu zuten, eta mikroskopioan ia desagertu egin ziren normalean nukleoa inguratzen duten inklusio urdin ilun eta moreak. Hala ere, bi inhibitzaileetako batek ere ez zuen moteldu zelulaz kanpoko erredukzioa: ferrizianuroaren zikloak intentsitate berean jarraitu zuen, eta mintza zeharkatu ezin zuen polimeroa erreduzitzen jarraitu zen. Blokeoa beheragoko urrats batean zegoen. Zianuroak eta azidak zelula barruko berroxidazioa eta bahiketa geldiarazten zituzten, ez gainazaleko erredukzioa. Bideragarritasun-kontrolek interpretazio hori babestu zuten: tratamendu horietan zelulek beren entzima markatzaile zitosolikoa, laktato deshidrogenasa, barruan mantendu zuten. Hortaz, barneratzearen galera ez zen pozoitzearen edo mintzaren hausturaren ondorio hutsa.

Artikuluko ohar batek indarrean jarraitzen du. Inklusio urdinak nukleoaren inguruan zeuden, baina ez haren barruan; hori bateragarria zen oxidazioa organulu azpizelularretan gertatzearekin, baina azterketak ez zuen identifikatu zer organulu ziren. Beste zelula mota batzuetan ikusitako antzeko ereduak lisosomaltzat jo izan ziren, ebidentzia urriarekin. Harrapatzea frogatutzat hartu behar da, eta kokapena behin-behinekotzat. Elektroiak ondoren nora doazen jarraitu nahi duten irakurleek mitokondrietako elektroi-garraioari eta erredox-prozesuen kudeaketari buruzko artikuluan jarrai dezakete, baita bidearen araberako xurgapenaren eta banaketaren ikuspegi zabalagoan ere.

Tindaketa ez da esposizioa

Hirugarren azterketa batek erakusten du zer gertatzen den barneratzearen logika hori adierazle biologiko batekin elkartzen denean. Scottek eta lankideek aurkitu zuten metil beta ziklodextrinak, eraztun-formako azukre-toro batek, metileno-urdina zuzenean lotzen duela. Inklusio-konplexuaren elkartze-konstantea molarreko 310 ingurukoa da; tindagaiaren dimerizazioarena, berriz, molarreko 5846 ingurukoa. L929 fibroblastoetan, lotura horrek zelulen tindaketa eta glukosaren barneratzearen estimulazioa blokeatu zituen: ziklodextrinarekin aurrez inkubatzeak tindaketa urdina eragotzi zuen, eta ondoren gehitzeak koloregabetzea azkartu zuen. Seinale optiko urdina zeluletatik desagertu ahala, glukosa-garraio aktibatua ere ahuldu zen, paralelo estuan.

Egileek korrelazio hori interpretatu zuten tindagaiaren eta glukosa-garraiatzailearen aktibazio-bideko proteina baten arteko zuzeneko elkarrekintzaren aldeko ebidentzia gisa, iraupen luzeko estres oxidatiboaren mekanismo baten ordez. Ondorio hori arrazoizkoa da, baina mugatua. Esperimentuak ez du proteina identifikatzen, ez du erakusten tindagaia garraiatzaileari berari lotzen zaionik, eta koloregabetzearen eta efektu-galeraren arteko korrelazioak ezin ditu erredox bidezko bide guztiak baztertu.

Ikasgai iraunkorra neurketari buruzkoa da. Tindaketa optikoak zelulei lotutako tindagai ikusgai eta oxidatuaren berri ematen du. Forma erreduzitu kolorgearen multzo osoa ikusezina zaio; beraz, zelula zurbil batek oraindik tindagai-baliokideak eduki ditzake, eta intentsitate handiz tindatutako zelula batek harrapatutako tindagai oxidatuaren berri ematen du, ez ehunaren esposizio osoarena edo efektuaren tamainarena. Ohar bera eskala handiagoan ere aplikatzen da: zelula mota desberdinen tindaketa alderatzeak, edo ehun-ebaki ilun bat esposizio handiagoaren frogatzat hartzeak, kultibo-plakaren hasierako akatsa errepikatzen du. Barneratzea erredukzioaren, difusioaren eta berroxidazioaren zikloa da, eta forma urdinaren une bakarreko irudi batek ziklo horren zati bat besterik ez du erakusten. Hortik zuzenean eratortzen dira laborategiko tindaketarako eta manipulaziorako ondorio praktikoak, baita dosiari eta esposizioari buruzko baieztapenak interpretatzekoak ere.