Metüleensinine ja mitokondrid: elektrontransport ja tõendid

Kujutlege kaht preparaati kõrvuti. Mõlemad sisaldavad aju mitokondreid, mida on mürgitatud rotenooniga — kemikaaliga, mis blokeerib hingamisahela kompleksi I. Ühte pipeteerib katsetaja mikromolaarse annuse metüleensinist. Hapnikutarbimine taastub osaliselt. Membraanipotentsiaal taastub osaliselt. Vähesel määral käivitub uuesti ATP süntees. Kõrvalküvetis näitab peroksiidiandur loo teist poolt: vesinikperoksiidi teke on suurenenud mitu korda iga katsetatud annuse ja kõigi proovitud substraatide korral.

Mõlemad mõõtmistulemused on õiged. Metüleensinine on elektronide ülekandja, mis võib hoida elektronivoolu käigus, suunates selle hingamisahela kahjustatud osast mööda, kuid sama ülekandega kaasneb peroksiidi teke. Kui pidada mõlemat tõsiasja korraga meeles, muutub metüleensinise ja mitokondrite talitluse teaduskirjandus arusaadavaks. Kui arvestada vaid ühega, paistab see ime või ohuna olenevalt sellest, millist artiklit esimesena lugesite.

Elektronide ülekanne lihtsas sõnastuses

Hingamisahel on ülekandejada. Elektronid sisenevad kompleksi I kaudu (NADH-st) või kompleksi II ja sellega seotud flaviinensüümide kaudu (suktsinaadist ja sarnastest doonoritest), liiguvad läbi kompleksi III liikuvale kandjale tsütokroom c ning seejärel läbi kompleksi IV hapnikule. Iga ülekanne pumpab prootoneid üle sisemembraani ning tekkiv gradient käitab ATP sünteesi. Kui mõni lüli blokeerida, vaibub sellest ülesvoolu jääva ahela aktiivsus.

Metüleensinine lisandub paralleelse kullerina. Selle oksüdeerunud vorm võtab ülesvoolu kandjatelt elektrone vastu ja muutub värvituks redutseerunud vormiks, leukometüleensiniseks, mis annab elektronid edasi allavoolu ning muutub taas siniseks. Neid kaht vormi kirjeldab redokspaari käsitlus ning laiemat ülekandekäitumist selgitab üldise toimemehhanismi ülevaade. Lahtine küsimus on, kus kuller ahelasse tagasi siseneb: kas kompleksi III kinooli sidumistaskus, mida tuntakse Qo saidina, või otse tsütokroom c juures. See, kumb väljumistee domineerib, sõltub tingimustest, nagu selgitab üksikasjalikult kompleksist III möödumise analüüs.

Mida kolm näriliste uuringut tegelikult mõõtsid

Kõigis kolmes uuringus kasutati isoleeritud aju mitokondreid ehk rakust eemaldatud ja kindla koostisega puhverlahusesse suspendeeritud organelle. Ei kasutatud terviklikke rakke, loomadele ei manustatud ainet ega kaasatud inimesi. Kontsentratsioonid viitavad organelle ümbritsevale lahusele, mitte inimese suukaudsele annusele. Kui hoida seda raamistikku meeles, kõnelevad arvud selgelt.

Esimene uuring, milles kasutati isoleeritud merisea aju mitokondreid kontsentratsioonidel 100 nanomolaarsest kuni 2 mikromolaarseni, kaardistas ühes preparaadis nii kasu kui ka sellega kaasneva koormuse. Tervetes mitokondrites suurendas värvaine puhkeoleku hapnikutarbimist, kuid jättis ADP-ga stimuleeritud hingamise muutumatuks, seega ei paranenud hingamisega seotud ATP tootmine. Kompleksi I blokaadi korral taastas 2 mikromolaarne kontsentratsioon ATP sünteesi tasemelt 46 tasemele 93 nanomooli minutis milligrammi kohta, samas kui normaalne tase oli ligikaudu 1109. Kompleksi III blokaadi korral taastas sama annus ATP tootmise ligikaudu tasemelt 46 tasemele 63, samas kui normaalne tase oli ligikaudu 910. Membraanipotentsiaal ja kaltsiumi omastamine taastusid osaliselt. Kompleksi IV tsüaniidiblokaadist ei olnud võimalik mööduda, mis paigutab kasuliku elektronide väljumiskoha toimivast kompleksist IV ülesvoolu. Iga taastumine oli statistiliselt tõeline, kuid väike: normaalsest ATP tootmisest taastusid vaid ühekohalised protsendimäärad.

Teine uuring, milles kasutati hiire ajukoore mitokondreid ligikaudu 1 mikromolaarse kontsentratsiooni juures, kinnitas kompleksist I möödumist ja näitas piiri kompleksi III juures. Rotenoon vähendas hingamist ligikaudu 121 nanomoolilt alla 2 nanomooli hapniku minutis milligrammi kohta ning värvaine tõstis selle ligikaudu 21-ni, umbes kuuendikuni normaalsest, samal ajal kui membraanipotentsiaal taastus peaaegu täielikult. Kuid pärast kompleksi III blokeerimist ei taastunud kontsentratsioonivahemikus 1 kuni 5 mikromolaarset ei hingamine ega membraanipotentsiaal ning blokaad surus maha värvaine põhjustatud peroksiidisignaali. Autorid pakkusid välja, et redutseerunud värvaine annab oma elektronid üle kompleksi III Qo saidil: kui see sait on hõivatud, pole kulleril kuhugi saadetist toimetada.

Kolmas uuring, milles kasutati hiire, roti ja merisea aju mitokondreid peamiselt 2 mikromolaarse kontsentratsiooni juures, kontrollis vastuolu otseselt ja leidis, et kompleksi III blokaadist saab mööduda. Kui Qo saidi inhibiitor müksotiasool vähendas basaalset hingamist 88 protsenti, taastas värvaine hapnikutarbimise ligikaudu 62 protsendini blokeerimata tasemest. Otseses katses redutseeris poole mikromolaarne kontsentratsioon eksogeenset tsütokroom c-d isegi siis, kui kompleks III oli blokeeritud, toetades elektronide liikumisteed NADH-st värvaine kaudu tsütokroom c-le ja edasi kompleksile IV. Taastunud hingamine käitus siiski ebatavaliselt: lisatud ADP vähendas hapnikutarbimist, mitte ei suurendanud seda, ning ATP sünteesi blokeerimine stimuleeris hingamist. Membraan repolariseerus vaid osaliselt. Suur hapnikutarbimine koos vastupidise seostumiskäitumisega ei ole normaalne energiatootmine.

Miks laborite tulemused erinevad ja mis selle selgitab

Liikide erinevus ei sobi esimeseks selgituseks. Kolmas rühm kordas katseid kolme näriliseliigiga ja leidis kõigil kvalitatiivselt sama möödumise, sealhulgas hiireliinil, mille puhul oli varem teatatud möödumise puudumisest. Erinevad hoopis kontsentratsioon (1 versus 2 mikromolaarne), inhibiitorite annused, puhverlahused, isoleerimismeetodid ja eelkõige võrreldav energeetiline seisund: möödumine on kõige selgem enne ADP lisamist, just seal, kus ilmneb paradoksaalne vastus ADP-le. Aus skeem näitab seetõttu kaht tingimustest sõltuvat väljumisteed, üht Qo saidi ja teist tsütokroom c juures. Kuller annab saadetise üle seal, kus kohalik keemia seda võimaldab.

Peroksiidi hind

Kaasnev koormus on sama järjekindel kui talitluse osaline taastumine. Merisigade uuringus suurendas värvaine peroksiidi vabanemist kõigis katsetatud tingimustes — puhkeolekus, ATP sünteesi ajal ja keemiliselt kahjustatud seisundis — kõigi kolme substraadi korral. ATP sünteesi ajal suurenes teke 1 mikromolaarse kontsentratsiooni juures ligikaudu 148 pikomoolilt üle 1500 pikomooli minutis milligrammi kohta ning isegi 100 nanomolaarne kontsentratsioon suurendas signaali rohkem kui neli korda. Värvaine aeglustas ka peroksiidi kõrvaldamist ligikaudu 2.6 korda, seega peegeldab signaal nii kiiremat teket kui ka aeglasemat eemaldamist. Pakutud keemiline seletus on hapniku otsene redutseerimine redutseerunud värvaine poolt ilma tuvastatava superoksiidita, kuid see on endiselt tõlgendus, mitte tõestatud reaktsioonietapp.

Hiirte uuring muudab pildi kasulikul viisil keerukamaks. Peroksiidi teke suurenes annusega järsult: ligikaudu 76 pikomooli suuruselt lähtetasemelt peaaegu 2000 pikomoolini minutis milligrammi kohta 2 mikromolaarse kontsentratsiooni juures, kuid kompleksi III blokeerimine surus värvaine põhjustatud osa maha. Kui peroksiid tekiks ainult redutseerunud värvaine reaktsioonist hapnikuga, ei tohiks ahela blokeerimine nii suurt mõju avaldada. Ent see avaldab, seega osaleb protsessis ka ahel. Antioksüdantse ja prooksüdantse toime ülevaade asetab selle kahesuse laiemasse konteksti ning hapniku ja ATP võrdlev analüüs selgitab, miks ainuüksi hapnikunäitajad ei tõesta kunagi energiaga seotud väidet.

Talitluse taastamine ei ole parandamine

Sõnastus, millest tuleks loobuda, on „kas metüleensinine parandab mitokondreid“. Parandamine tähendaks püsivat korrigeerimist: taastatud komplekse, hingamise ja ATP sünteesi seostumist, mis säilib pärast aine lahkumist, taastumist terviklikes rakkudes ning seejärel paranenud talitlust elusorganismis. Ükski neist kolmest artiklist seda ei näita. Need näitavad elektronide liikumise kiiret ümbersuunamist värskelt isoleeritud organellides kunstliku keemilise blokaadi ajal, kus ATP tootmine moodustab normaalsest vaid väikese osa ja seostumine on mõnikord lausa kummaline. Rotenoon ja antimütsiin on laborivahendid, mitte vananemise või inimese mitokondriaalsete haiguste mudelid, ning miski siin ei tähenda terve inimese jaoks suuremat energiahulka. See on eraldi tõendusküsimus, millel on oma inimestega tehtud uuringute kirjandus.

Kolm piirangut aitavad hoida kõik biohäkkimisega seotud järeldused ausana. Esiteks ei ole inkubatsioonilahuse kontsentratsioon annus: 0.1 kuni 2 mikromolaarne kontsentratsioon isoleeritud organellide ümber ei ütle midagi selle kohta, milline suukaudne kogus tekitab sama vaba kontsentratsiooni inimese aju mitokondri juures, eriti kuna värvaine kogunemine või vabanemine sõltub membraanipotentsiaalist endast. Teiseks ei ole hapnik energia: värvaine võib suurendada hapnikutarbimist nii tsüklilise elektronide ülekande ja lekke kui ka tulemusliku fosforüülimise kaudu, mistõttu ei saa respiromeetria ilma ATP ja membraanipotentsiaali mõõtmisteta õigustada energiaga seotud väidet. Kolmandaks peavad kasu ja koormus mahtuma samasse lausesse: iga väide membraanipotentsiaali või ATP tootmise taastumisest, mis jätab välja kaasneva peroksiiditaseme tõusu, annab katsest vale pildi. Seotud täpsustusi käsitlevad NAD redokstasakaal, annuse-vastuse kõvera kuju ja mõõtmismeetodite juhend.

Üks praktiline lisamärkus: elektronide ülekanne on just selle konkreetse molekuli omadus. Demetüleeritud sugulasühendid, näiteks Azure B, on samuti redoksaktiivsed, kuid käituvad teisiti, seega on osaliselt lagunenud lahusega tehtud katse teistsugune kui muutumatu värvainega tehtud katse. See on üks põhjus nõuda täielikku farmakopöa spetsifikatsiooni ja avaldatud partiidokumenti, mitte ainult metallide analüüsi. Valguse toimel käivituv keemia lisab valgustatud kasutusviisidele samalaadse piirangu, mida käsitleb punase valgusega kombineerimise ülevaade.

Kitsas väide peab kõigele sellele vastu ja väärib säilitamist: metüleensinine võib kahjustatud isoleeritud mitokondrites toimida tingimusliku elektronikullerina, säilitades osaliselt elektronivoolu peroksiidi tekke hinnaga. Kõik sellest kaugemale ulatuv — energia, pikaealisus, parandamine — ootab tõendeid, mille andmiseks neid uuringuid ei kavandatud.