Alternativas al azul de metileno para microscopía: elige según la tarea

Para un frotis bacteriano sencillo, el violeta de cristal puede sustituir al azul de metileno cuando el objetivo es observar la forma de las células. Para células vivas, una alternativa mejor puede ser el contraste de fases sin ninguna tinción. La elección depende de la observación que necesites realizar.

Supón que dos personas están examinando el mismo cultivo bacteriano. Una quiere distinguir los bacilos de las células redondas. La otra quiere saber si un tratamiento ha matado las bacterias. Una tinción que ofrece a la primera persona una imagen clara puede no proporcionar a la segunda ninguna respuesta útil.

Antes de elegir un sustituto, completa esta frase: “Necesito observar ___ en ___, y las células deben / no necesitan permanecer vivas.” Esa frase define la función que debe cumplir la tinción.

Empieza por la muestra y la pregunta

Primero decide si las células deben permanecer vivas y, después, identifica la característica que necesitas observar:

• Las células deben permanecer vivas: para observar el movimiento o la forma, considera el contraste de fases sin tinción o DIC; para el ADN nuclear, considera Hoechst 33342 con fluorescencia; para la integridad de la membrana, elige un ensayo validado como SYTO 9 con yoduro de propidio.
• Las células no necesitan permanecer vivas: para la morfología bacteriana, considera una tinción simple con violeta de cristal o una tinción negativa con nigrosina; para la reacción de Gram, utiliza el método completo de tinción de Gram; para el ADN nuclear en células fijadas, considera la fluorescencia con DAPI. Utiliza esta tabla para comparar las limitaciones de cada opción. Se trata de elecciones de método, no de instrucciones para intercambiar reactivos dentro de un protocolo existente.

Para un frotis sencillo, sustituye el método con cuidado

El violeta de cristal es una opción práctica cuando la tarea consiste en obtener una vista monocromática de la morfología bacteriana. El Bacteriological Analytical Manual de la FDA enumera dos formulaciones de violeta de cristal adecuadas para tinción simple. Utiliza una formulación documentada y su método de preparación; el nombre del colorante por sí solo no especifica un reactivo listo para usar.

El violeta de cristal también se utiliza en la tinción de Gram, pero eso no convierte una tinción simple con violeta de cristal en una tinción de Gram. En el protocolo de tinción de Gram de ASM, el resultado diferencial depende de la acción secuencial del violeta de cristal, el yodo, la decoloración y la contratinción. Omitir esos pasos cambia lo que puede determinarse a partir de la imagen. Consulta tinción simple frente a tinción de Gram para conocer esta diferencia.

La nigrosina ofrece una forma diferente de revelar los contornos: oscurece el fondo mientras las células bacterianas permanecen comparativamente claras. Hay un detalle útil en las instrucciones de Merck sobre la nigrosina que una lista genérica de sustitutos puede pasar por alto. Su formulación de trabajo especificada contiene formaldehído. Por tanto, no puedes deducir la compatibilidad con células vivas a partir de las palabras «tinción negativa», aunque las propias células parezcan no estar teñidas. Comprueba la formulación completa y la preparación de la muestra.

Para muestras vivas, considera cambiar la óptica

Si quieres observar cómo se mueven o dividen las células, introducir otro colorante puede complicar la observación. Como explica Nikon en su guía sobre el contraste en muestras transparentes, el contraste de fases y el contraste de interferencia diferencial, o DIC, hacen visibles las muestras mediante diferencias en sus propiedades ópticas. Pueden revelar células vivas sin teñir, siempre que el microscopio disponga de los componentes necesarios.

Esta opción conserva una preparación sin teñir, pero cambia la información disponible. Puedes seguir un límite celular o un movimiento sin saber qué molécula produjo el contraste. Si la pregunta es la localización molecular, selecciona en su lugar un método de marcaje adecuado.

Para el ADN nuclear, la comparación de tinciones DAPI y Hoechst de Invitrogen distingue el uso habitual de DAPI con células fijadas del Hoechst 33342, más permeable a las células y preferido para el marcaje de células vivas. Ambos requieren equipos de fluorescencia. Ninguno es un sustituto directo de una tinción coloreada para campo claro.

Considera la exposición al colorante y la iluminación como condiciones experimentales. Compara preparaciones teñidas y sin teñir cuando el comportamiento de las células sea la variable que estás midiendo.

Una célula roja no es automáticamente una célula muerta

SYTO 9 y el yoduro de propidio suelen utilizarse conjuntamente para evaluar la integridad de la membrana bacteriana. El manual de BacLight asocia las membranas intactas con tinción verde y las membranas dañadas con tinción roja. Esa interpretación debe validarse para la muestra.

Un estudio de 2019 de Rosenberg y colaboradores ilustra el problema. En biopelículas de E. coli de 24-hour sobre vidrio en solución salina tamponada con fosfato, aproximadamente el 96% de las células parecían positivas para yoduro de propidio in situ. Sin embargo, los autores estimaron que el 82% eran cultivables después de la recolección. Las imágenes confocales mostraron células con interiores verdes bajo material teñido de rojo, lo que señalaba a los ácidos nucleicos extracelulares como responsables de la señal engañosa.

Esos porcentajes describen mediciones diferentes realizadas en las preparaciones del estudio, no un factor de corrección universal. La lección útil es comprobar qué generó la señal. En una biopelícula, un colorante de ácidos nucleicos puede detectar material fuera de las células, además de material dentro de células dañadas. Para llegar a una conclusión sobre viabilidad, los investigadores recomiendan mediciones complementarias, como el cultivo o la actividad metabólica, reconociendo al mismo tiempo que cada una tiene limitaciones.

Comprueba qué contiene realmente la alternativa

Un método de tinción alternativo puede seguir conteniendo azul de metileno. Giemsa es un ejemplo: Merck describe su producto como una solución de azure-eosina-azul de metileno, destinada a aplicaciones que incluyen frotis de sangre y médula ósea. Puede ser un método diferente para una muestra diferente, pero no cumple un requisito de exclusión del azul de metileno.

Si excluir un compuesto forma parte del experimento, comprueba la identidad y la formulación del reactivo antes de comparar imágenes. La guía sobre azul de metilo, azul de metileno y colorantes con nombres similares aborda las diferencias de nomenclatura.

Verifica la sustitución antes de utilizar el resultado

Para un método nuevo, realiza una pequeña comparación utilizando muestras representativas y un control adecuado. Mantén comparables los ajustes del microscopio siempre que sea posible. Registra la formulación del reactivo, la preparación de la muestra, la exposición y las condiciones de obtención de imágenes para que una imagen de mejor aspecto pueda investigarse en lugar de simplemente preferirse.

Evalúa el éxito en función de la pregunta original. Para la morfología, determina si los límites y la disposición celulares siguen siendo interpretables. Para el marcaje nuclear, evalúa la ubicación de la señal y el fondo. Para la viabilidad, exige evidencia adicional a una separación de colores visualmente atractiva. La guía más amplia sobre tinción con azul de metileno y aplicaciones de laboratorio explica cómo encajan la observación y la preparación.

Elige la alternativa que conserve la medición que necesitas. El color es solo una propiedad de la imagen resultante.