Τα πειράματα που συνέδεσαν το κυανό του μεθυλενίου με την κυτταρική αναπνοή

Το ανθρώπινο αίμα από το οποίο έχει αφαιρεθεί το ινώδες, όταν διατηρείται στους 37 °C για τρεις ώρες, καταναλώνει περίπου το δύο τοις εκατό του οξυγόνου που περιέχει. Αν προστεθεί μια μικρή ποσότητα κυανού του μεθυλενίου πριν από την επώαση, το ίδιο αίμα καταναλώνει περίπου το εξήντα πέντε τοις εκατό. Τίποτα δεν άλλαξε στα κύτταρα. Άλλαξε μόνο το διάλυμα.

Αυτός ο αριθμός προέρχεται από μια δημοσίευση του 1928 των George Harrop και E. S. Guzman Barron στο Johns Hopkins και αποτελεί την αφετηρία του ευρέως επαναλαμβανόμενου ισχυρισμού ότι το κυανό του μεθυλενίου βελτιώνει την κυτταρική αναπνοή. Ο ισχυρισμός δεν είναι λανθασμένος, αλλά έχει πιο περιορισμένο νόημα απ’ όσο ακούγεται.

Τι μετρά πραγματικά ο αριθμός στον πίνακα

Το μετρούμενο μέγεθος ήταν η πρόσληψη οξυγόνου, η οποία προσδιοριζόταν με ανάλυση αερίων. Οι Harrop και Barron διήθησαν φρεσκοληφθέν αίμα μέσα από βαμβάκι στους 10 °C για να απομακρύνουν τα λευκοκύτταρα, κορέσαν το δείγμα με οξυγόνο, το χώρισαν, πρόσθεσαν χρωστική στο ένα μέρος και ανέλυσαν και τα δύο μετά την επώαση. Ο αριθμός των λευκοκυττάρων σπάνια ξεπερνούσε περίπου τα χίλια ανά κυβικό χιλιοστό. Η κατανάλωση οξυγόνου αναφερόταν ως το ποσοστό της αρχικής περιεκτικότητας του δείγματος σε οξυγόνο που είχε εξαφανιστεί.

Μέτρησαν επίσης το διοξείδιο του άνθρακα, και εκεί η μέθοδος παρουσίασε δυσκολίες. Το αίμα από το οποίο είχε αφαιρεθεί το ινώδες απελευθέρωνε έως δύο χιλιοστογραμμομόρια διοξειδίου του άνθρακα ανά 100 mL κατά την πρώτη ώρα επώασης, για λόγους άσχετους με την υπό μελέτη αντίδραση. Έτσι, τα αναπνευστικά πηλίκα από ολικό αίμα δεν μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν. Μόνο τα πλυμένα κύτταρα σε διάλυμα Locke έδωσαν ερμηνεύσιμες τιμές, οι οποίες συγκεντρώνονταν μεταξύ 0.73 και 0.80, με και χωρίς τη χρωστική.

Αυτή η λεπτομέρεια δεν είναι επουσιώδης. Η «αναπνοή» σε αυτές τις δημοσιεύσεις σημαίνει ανταλλαγή αερίων μέσα σε ένα κλειστό δοχείο. Το χάσμα ανάμεσα στην κατανάλωση οξυγόνου και την παραγωγή αξιοποιήσιμης ενέργειας εξετάζεται ξεχωριστά στο τι μας λέει και τι δεν μας λέει η κατανάλωση οξυγόνου για το ATP.

Η χρωστική πρόσθετε περισσότερο εκεί όπου τα κύτταρα ανέπνεαν λιγότερο

Τα ώριμα ερυθροκύτταρα των θηλαστικών δεν εμφανίζουν σχεδόν καθόλου μετρήσιμη κατανάλωση οξυγόνου. Τα εμπύρηνα ερυθροκύτταρα των πτηνών εμφανίζουν. Οι Harrop και Barron εξέτασαν και τα δύο, και αυτή η αντίθεση αποτελεί τον πυρήνα του επιχειρήματός τους.

Στα δείγματα θηλαστικών, η χρωστική προκάλεσε αυξήσεις κατά είκοσι έως πενήντα φορές. Στο αίμα χήνας, του οποίου τα κύτταρα ήδη ανέπνεαν, δεν υπερδιπλασίασε ποτέ τον ρυθμό. Όσο υψηλότερη ήταν η αρχική αναπνοή, τόσο λιγότερα μπορούσε να προσθέσει η χρωστική.

Η ίδια διαβάθμιση εμφανίζεται και μέσα στο ίδιο είδος. Ένα ανθρώπινο δείγμα από ασθενή με αληθή πολυκυτταραιμία, το οποίο περιείχε ανώριμα κύτταρα, κατανάλωνε το 11.3 τοις εκατό του οξυγόνου του χωρίς χρωστική, έναντι 2.8 τοις εκατό για πλυμένα κύτταρα από υγιή δότη. Η χρωστική το ανέβασε μόνο στο 63.4 τοις εκατό: εξαπλάσια επιτάχυνση, ενώ στα φυσιολογικά κύτταρα η επιτάχυνση ήταν σχεδόν τριακονταπλάσια. Η χρωστική ωθούσε τα ώριμα κύτταρα προς τη συμπεριφορά των ανώριμων, όπως ακριβώς υποστήριζαν οι συγγραφείς.

Το κυανίδιο θα έπρεπε να το είχε σταματήσει

Ήταν γνωστό ότι το κυανίδιο σταματούσε την κυτταρική οξείδωση. Οι Harrop και Barron το πρόσθεσαν παρ’ όλα αυτά, μαζί με τη χρωστική.

Τα αποτελέσματα από αίμα βοοειδών είναι αντιπροσωπευτικά. Η περιεκτικότητα σε οξυγόνο μειώθηκε από 22.61 σε 22.03 τοις εκατό κατ’ όγκο σε διάστημα τριών ωρών, χωρίς καμία προσθήκη. Με κυανό του μεθυλενίου μειώθηκε στο 12.84. Με κυανό του μεθυλενίου και κυανιούχο κάλιο σε συγκέντρωση ενός πεντακισχιλιοστού του molar, μειώθηκε στο 12.74. Η επίδραση της χρωστικής παρέμεινε ουσιαστικά ανεπηρέαστη.

Εικόνα: συνεχής καταγραφή μικροαναπνοής ανθρώπινων ερυθροκυττάρων. Το βέλος σημειώνει την προσθήκη κυανού του μεθυλενίου. Πριν από αυτήν, η καμπύλη είναι σχεδόν επίπεδη· μετά, ανεβαίνει σταθερά. Αναπαραγωγή από τους Harrop και Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Το συμπέρασμά τους ήταν ότι η χρωστική λειτουργούσε ως φορέας οξυγόνου, «παρέχοντας μια ουσία που έχει εξαφανιστεί από τα απύρηνα ερυθροκύτταρα των ενήλικων θηλαστικών». Δύο χρόνια αργότερα, οι Michaelis και Salomon στο Ινστιτούτο Rockefeller διατύπωσαν τη διαφωνία με τρόπο που παραμένει επίκαιρος. Είτε η επίδραση της χρωστικής ήταν «μια συμπτωματική ιδιότητα της χρωστικής» είτε η χρωστική ήταν «ένα πρότυπο για κάποια άγνωστη ουσία στους οργανισμούς». Αυτό το δίλημμα δεν έχει επιλυθεί. Εκείνο που έχει αλλάξει είναι ότι πλέον μπορούμε να περιγράψουμε τα κύτταρα με πολύ μεγαλύτερη ακρίβεια.

Ένα εκχύλισμα ήπατος έκανε το ίδιο

Οι Michaelis και Salomon έδειξαν ότι εκχυλίσματα οργάνων σε κρύο νερό προκαλούν την ίδια διέγερση. Το ήπαρ αρουραίου είχε την ισχυρότερη επίδραση, ακολουθούμενο από τον νεφρό, τον σπλήνα και τον όρχι. Ο εγκέφαλος, ο μυς και ο ορός του αίματος είχαν μικρή ή καθόλου επίδραση.

Στη συνέχεια δοκίμασαν το εκχύλισμα παρουσία μονοξειδίου του άνθρακα. Η αναπνοή που προκαλούνταν είτε από το εκχύλισμα είτε από τη χρωστική παρέμενε αμετάβλητη σε μείγμα με 98 τοις εκατό μονοξείδιο του άνθρακα και 2 τοις εκατό οξυγόνο. Το ίδιο μείγμα αερίων ανέστελλε την αναπνοή της ζύμης και των εμπύρηνων ερυθροκυττάρων ορνίθων κατά περίπου 60 έως 80 τοις εκατό, σε συμφωνία με την περιγραφή του Warburg για ένα αναπνευστικό ένζυμο ευαίσθητο στο μονοξείδιο του άνθρακα. Επομένως, η άγνωστη ουσία των ιστών δεν ήταν το ένζυμο του Warburg.

Στην πορεία αποκλείστηκαν αρκετές πιθανές ταυτότητες της ουσίας. Η ανηγμένη γλουταθειόνη και η κυστεΐνη προκαλούσαν μόνο την κατανάλωση οξυγόνου που απαιτούσε η δική τους οξείδωση. Το συνένζυμο των Harden και Young αποκλείστηκε επειδή ο μυς περιέχει τη μεγαλύτερη ποσότητά του, αλλά εμφάνιζε σχεδόν τη μικρότερη επίδραση. Το κυτόχρωμα του Keilin, που είχε ονομαστεί λίγα χρόνια νωρίτερα, προσέκρουε στην ίδια αντίφαση. Τη δική τους πρόταση, ότι η δραστική ουσία προερχόταν από τον κυτταρικό πυρήνα, τη χαρακτήρισαν απλή υπόθεση.

Η επίδραση απαιτούσε συγκεκριμένες συνθήκες

Τα κύτταρα έπρεπε να είναι ακέραια. Η αιμόλυση με απεσταγμένο νερό ή επαναλαμβανόμενη κατάψυξη εξάλειφε την απόκριση τόσο στη χρωστική όσο και στο εκχύλισμα, ενώ η μερική αιμόλυση τη μείωνε αναλογικά.

Απαιτούνταν επίσης σάκχαρο. Η γλυκόζη, η φρουκτόζη και η σακχαρόζη υποστήριζαν την αναπνοή που προκαλούσε η χρωστική· η μαννιτόλη όχι. Χωρίς σάκχαρο δεν υπήρχε καθόλου αναπνοή, και η χρωστική φαινόταν να βλάπτει τα κύτταρα κατά τη διαδικασία, οπότε η προσθήκη γλυκόζης μία ή δύο ώρες αργότερα δεν την αποκαθιστούσε. Οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι η χρωστική οξείδωνε κάποιο δομικό συστατικό απαραίτητο για το κύτταρο.

Ο φωτισμός αύξανε σημαντικά την επίδραση της χρωστικής, αν και η επίδραση ήταν σαφής και στο σκοτάδι. Άλλες αναγώγιμες χρωστικές συμπεριφέρονταν διαφορετικά: το κυανό της τολουυλένης είχε ίση ή μεγαλύτερη επίδραση από το κυανό του μεθυλενίου, ενώ το δισουλφονικό ινδικό είχε σχεδόν μηδενική επίδραση. Δεν προέκυψε σαφής σχέση ανάμεσα στο δυναμικό οξειδοαναγωγής μιας χρωστικής και το μέγεθος της επίδρασής της, κάτι που οι συγγραφείς απέδωσαν στη διαπερατότητα της μεμβράνης και την τοξικότητα.

Η επίδραση ακολουθούσε τη ζύμωση, όχι την αναπνοή

Η μελέτη του Barron το 1930 πέρασε από τα κυτταρικά εναιωρήματα στις τομές ιστών φυσιολογικών οργάνων αρουραίων και μεταμοσχευμένων όγκων.

Σε ιστούς χωρίς αερόβια γλυκόλυση, το κυανό του μεθυλενίου δεν είχε επίδραση ή περιόριζε ελαφρώς την κατανάλωση οξυγόνου: στον νεφρό κατά περίπου 14 τοις εκατό, στο πάγκρεας κατά περίπου 14 τοις εκατό, στο ήπαρ κατά περίπου 5 τοις εκατό. Σε ιστούς που πραγματοποιούν ζύμωση παρουσία οξυγόνου, αύξανε την κατανάλωση: στον σπλήνα κατά περίπου 8 τοις εκατό, στον εγκέφαλο κατά περίπου 13 τοις εκατό. Οι αυξήσεις στους όγκους κυμαίνονταν από περίπου 27 τοις εκατό σε ανθρώπινο καρκίνωμα του μαστού έως πάνω από 80 τοις εκατό σε σάρκωμα Rous όρνιθας, περίπου ανάλογα με την αερόβια γλυκόλυση κάθε ιστού.

Εικόνα: κάθε σημείο αντιστοιχεί σε έναν τύπο ιστού. Ο οριζόντιος άξονας δείχνει την αερόβια γλυκόλυση· ο κατακόρυφος άξονας δείχνει τη μεταβολή στην κατανάλωση οξυγόνου μετά την προσθήκη κυανού του μεθυλενίου. Δεδομένα από τον Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Πίνακας 6, PMID 19869777.

Το πείραμα με κυανίδιο έδωσε στη συνέχεια την αντίστροφη εικόνα. Όταν η αναπνοή στους προηγουμένως μη αποκρινόμενους ιστούς αναστάλθηκε με κυανίδιο και η ζύμωση ήρθε στο προσκήνιο, η χρωστική αύξησε ξανά την κατανάλωση οξυγόνου: στον νεφρό κατά περίπου 59 τοις εκατό, στο ήπαρ κατά περίπου 19 τοις εκατό, στον σπλήνα κατά περίπου 286 τοις εκατό, στον όρχι κατά περίπου 200 τοις εκατό.

Ο Barron πρότεινε ότι η χρωστική θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως δοκιμασία της ζυμωτικής ικανότητας ενός κυττάρου ή ιστού και έκλεισε με μια εικασία: διαδοχικές γενιές καλλιέργειας όγκων σε μέσο που περιέχει τη χρωστική ίσως κάποτε έκαναν τον μεταβολισμό ενός όγκου μόνιμα όμοιο με εκείνον του φυσιολογικού ιστού. Αυτό ήταν ένα ερευνητικό ερώτημα γραμμένο το 1930. Δεν αποτελεί ισχυρισμό για θεραπεία.

Τι δεν θα μπορούσαν να είχαν μετρήσει τα πειράματα

Το 1928 και το 1930, «αναπνοή» σήμαινε κατανάλωση οξυγόνου. Η τριφωσφορική αδενοσίνη αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1929, ενώ η απόδειξη ότι τα απομονωμένα μιτοχόνδρια εστεροποιούν φωσφορικά καθώς μεταφέρουν ηλεκτρόνια ήρθε το 1949. Καμία από τις πρώιμες δημοσιεύσεις για το κυανό του μεθυλενίου δεν θα μπορούσε να είχε μετρήσει την παραγωγή ενέργειας, και καμία δεν ισχυρίστηκε ότι το έκανε.

Τα κύτταρα αποτελούν το δεύτερο πρόβλημα. Τα ώριμα ερυθροκύτταρα των θηλαστικών δεν περιέχουν μιτοχόνδρια. Κατά το στάδιο του δικτυοερυθροκυττάρου απομακρύνουν τα μιτοχόνδρια και τα ριβοσώματα μέσω επιλεκτικής αυτοφαγίας. Γι’ αυτό ένα ώριμο ερυθροκύτταρο λειτουργεί με γλυκόλυση και εξαρτάται από την οδό των φωσφορικών πεντοζών κυρίως για NADPH και όχι για ATP. Στα πειράματα του 1928 δεν υπήρχε αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων που θα μπορούσε να αποκατασταθεί. Ό,τι κατανάλωνε το οξυγόνο έκανε κάτι άλλο.

Το τι ήταν αυτό το «κάτι άλλο» περιγράφεται πλέον αρκετά καλά. Το κυανό του μεθυλενίου δέχεται ηλεκτρόνια από κυτταρικά αναγωγικά ισοδύναμα και μετατρέπεται σε λευκοκυανό του μεθυλενίου, το οποίο επανοξειδώνεται από μοριακό οξυγόνο, κλείνοντας τον κύκλο. Στα ανθρώπινα ερυθροκύτταρα, η εξαρτώμενη από NADPH αναγωγάση φλαβίνης και συγγενείς αναγωγάσες δισουλφιδίων πραγματοποιούν το στάδιο της αναγωγής. Μια μελέτη του 1976 με σημασμένη γλυκόζη διαπίστωσε ότι η χρωστική διεγείρει την παρακαμπτήρια οδό των μονοφωσφορικών εξοζών, ότι η επίδραση σε χαμηλή συγκέντρωση εξαρτιόταν από την οξυαιμοσφαιρίνη και ότι μια υψηλότερη συγκέντρωση, 0.1 mM, παρήγαγε υπεροξείδιο του υδρογόνου. Μια ανηγμένη χρωστική που έρχεται σε επαφή με οξυγόνο παράγει υπεροξείδιο, όχι φωσφορικούς δεσμούς.

Στα μιτοχόνδρια, η εικόνα είναι πιο αμφισβητούμενη απ’ όσο αφήνουν να φανεί οι εκλαϊκευμένες περιλήψεις. Μία ερευνητική κατεύθυνση υποστηρίζει ότι η χρωστική προσλαμβάνει ηλεκτρόνια από την περιοχή του συμπλόκου I και τα μεταφέρει στο κυτόχρωμα c. Μια άλλη διαπίστωσε ότι στα μιτοχόνδρια του εγκεφάλου ποντικού δεν μπορεί να αποκαταστήσει την αναπνοή μετά από αναστολή με αντιμυκίνη και τοποθέτησε τον δέκτη ηλεκτρονίων στη θέση δέσμευσης της ουβικινόλης του συμπλόκου III. Μια τρίτη διαπίστωσε ότι οι χαμηλές συγκεντρώσεις αύξαναν την κατανάλωση οξυγόνου σε κατάσταση ηρεμίας, αφήνοντας αμετάβλητη την αναπνοή που διεγείρεται από ADP. Η πιο άμεση διατύπωση του ζητήματος είναι ότι η κατανάλωση οξυγόνου που προκαλεί το κυανό του μεθυλενίου δεν εξαρτάται καθόλου από την οξειδωτική φωσφορυλίωση: συνεχιζόταν όταν η αναπνευστική αλυσίδα είχε ανασταλεί, αλλά και σε παρασκευάσματα χωρίς αναπνευστική αλυσίδα.

Υπάρχουν επίσης άμεσες μετρήσεις του χάσματος ανάμεσα στα δύο μεγέθη. Σε απομονωμένα μιτοχόνδρια ήπατος αρουραίου, οι αυξανόμενες συγκεντρώσεις χρωστικής μείωναν τους λόγους αναπνευστικού ελέγχου και προκαλούσαν διόγκωση, κάτι που οι συγγραφείς περιέγραψαν ως αποσύζευξη της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Σε ήπαρ αρουραίου υπό αιμάτωση, το κυανό του μεθυλενίου αύξανε την κατανάλωση οξυγόνου ενώ ο λόγος ATP προς ADP μειωνόταν.

Τα κλινικά δεδομένα μεταφέρουν το ίδιο μήνυμα. Η μεθαιμοσφαιριναιμία αντιμετωπίζεται με περίπου ένα έως δύο χιλιοστόγραμμα κυανού του μεθυλενίου ανά χιλιόγραμμο ενδοφλεβίως, μέσω μιας εξαρτώμενης από NADPH οδού αναγωγής, ενώ οι μεγαλύτερες δόσεις προκαλούν την ίδια την πάθηση που αντιμετωπίζεται. Η ίδια ανασκόπηση σημειώνει ότι η αντιδοτική επίδραση είναι μεγαλύτερη στα ακέραια ερυθροκύτταρα και μειώνεται όταν υπάρχει αιμόλυση. Πρόκειται για το εύρημα της αιμόλυσης του 1930 που επανεμφανίζεται εβδομήντα τρία χρόνια αργότερα σε νοσοκομειακό πλαίσιο. Μια ένωση της οποίας οι ωφέλιμες και οι βλαβερές επιδράσεις βρίσκονται στις αντίθετες πλευρές ενός δοσολογικού ορίου δεν είναι μια ένωση της οποίας η δόση θα πρέπει να συνάγεται από μια μέτρηση κατανάλωσης οξυγόνου.

Γιατί η παρτίδα έχει θέση στη συζήτηση

Οι Harrop και Barron παρατήρησαν κάτι που αξίζει μια δεύτερη ανάγνωση. Το ίδιο το κυανό του μεθυλενίου παράγει στο φασματοσκόπιο μια ζώνη ανάμεσα στις δύο χαρακτηριστικές ζώνες της μεθαιμοσφαιρίνης, «η οποία μπορεί εύκολα να προκαλέσει σύγχυση κατά μια πρόχειρη εξέταση». Η χρωστική μπορεί να μιμηθεί την ουσία που αναζητείται.

Το ίδιο πρόβλημα έχει και χημική διάσταση. Μια συγγενής φαινοθειαζίνη που υπάρχει ως συστατικό μικρής περιεκτικότητας έχει τη δική της οξειδοαναγωγική συμπεριφορά, τη δική της διαπερατότητα και τη δική της τοξικότητα. Μία τεκμηριωμένη περίπτωση δείχνει συγκεκριμένα τι διακυβεύεται: σε μελέτη της ιωδίωσης του κυανού του μεθυλενίου, δείγματα που περιείχαν περίπου 7 έως 8 τοις εκατό Azure B παρήγαγαν κυρίως ιωδιωμένο Azure B, οπότε στην αντίδραση κυριαρχούσε η πρόσμειξη και όχι το κυανό του μεθυλενίου.

Όποιος χρησιμοποιεί κυανό του μεθυλενίου ως αντιδραστήριο, σε εργαστήριο, σε πάγκο χρώσεων ή σε ενυδρείο, εργάζεται με ένα συστατικό μη προσδιορισμένης σύστασης, εκτός αν η παρτίδα έχει χαρακτηριστεί. Οι συγγενείς ουσίες, η ταυτοποίηση, οι στοιχειακές προσμείξεις, οι υπολειμματικοί διαλύτες και το υπόλειμμα μετά από πύρωση αποτελούν μέρος του πειράματος και όχι απλή γραφειοκρατία γύρω από αυτό. Η Blupreme προμηθεύεται το κυανό του μεθυλενίου της από φαρμακευτικό παρασκευαστή και δημοσιεύει πλήρες πιστοποιητικό ανάλυσης, ελέγχοντας ολόκληρη την προδιαγραφή USP και όχι μόνο τα βαρέα μέταλλα· ο οδηγός ανάγνωσης ενός πιστοποιητικού ανάλυσης και το τι τεκμηριώνει και τι δεν τεκμηριώνει ο χαρακτηρισμός ποιότητας USP εξηγούν πώς να ελέγξετε αν το έγγραφο στηρίζει τον ισχυρισμό.

Ο αριθμός ήταν σωστός

Τα πειράματα του 1928 και του 1930 ήταν προσεκτικά, και η κεντρική τους παρατήρηση έχει αντέξει: μια αναγώγιμη χρωστική μπορεί να κάνει ένα κύτταρο που σχεδόν δεν αναπνέει να καταναλώνει οξυγόνο με ρυθμό πολλαπλάσιο εκείνου της ηρεμίας, χωρίς να περνά από το στάδιο που αναστέλλει το κυανίδιο.

Το λάθος εμφανίζεται αργότερα, όταν η «αναπνοή» διαβάζεται με τη σύγχρονη σημασία της. Μια μέτρηση ανταλλαγής αερίων μας λέει ότι ηλεκτρόνια έφτασαν στο οξυγόνο. Δεν μας λέει ότι κάποια από αυτά χρησιμοποιήθηκαν για την παραγωγή ATP, και σε ένα κύτταρο χωρίς μιτοχόνδρια η απόσταση ανάμεσα σε αυτές τις δύο δηλώσεις είναι η μεγαλύτερη δυνατή. Ο ευρύτερος χάρτης του τι κάνει το κυανό του μεθυλενίου στα κύτταρα τοποθετεί την ίδια διάκριση σε ευρύτερο πλαίσιο, ενώ η ιστορία της ένωσης από χρωστική σε φάρμακο εξηγεί πώς μια χρωστική υφασμάτων έφτασε εξαρχής σε αυτά τα πειράματα.