Η ιστορία του κυανού του μεθυλενίου: από βαφή σε φάρμακο και έρευνα

Το κυανό του μεθυλενίου έφτασε σε ασθενή πριν φτάσει σε φαρμακείο.

Η αναφορά του 1891 από τους Paul Guttmann και Paul Ehrlich σχετικά με τη χρήση της βαφής στην ελονοσία περιέχει δύο διαγράμματα θερμοκρασίας. Το δεύτερο καλύπτει την περίοδο από 13 Ιουλίου έως 5 Αυγούστου, με τη θεραπεία καταγεγραμμένη στο περιθώριο ημέρα προς ημέρα. Οι καταχωρίσεις στις 18 και 19 Ιουλίου γράφουν «1 × 0,05 Methylenblau». Τις επόμενες ημέρες αναφέρονται πέντε και επτά δόσεις της ίδιας ποσότητας, ενώ έως τις 22 Ιουλίου έχει προστεθεί στην καταγραφή και μια μικρή ποσότητα κινίνης. Η γραμμή του πυρετού, η οποία κυμαίνεται μεταξύ 37 °C και 39.5 °C στο πρώτο μισό του διαγράμματος, εξομαλύνεται μετά την εμφάνιση της βαφής και παραμένει μεταξύ περίπου 36 °C και 37.5 °C για τις υπόλοιπες τρεις εβδομάδες.

Ο ασθενής ήταν ένας από δύο, οι οποίοι περιγράφονται στη δημοσίευση ως οικιακός υπηρέτης και ναυτικός. Η ένωση που έλαβαν ήταν εμπορική βαφή υφασμάτων επί δεκαπέντε χρόνια, και οι δύο άνδρες συγκαταλέγονται στους πρώτους ανθρώπους που έχουν καταγραφεί ότι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με πλήρως συνθετικό φάρμακο που στόχευε συγκεκριμένο οργανισμό.

Πρώτα ήρθε η βαφή

Η πρώτη εμπορικά επιτυχημένη συνθετική βαφή δημιουργήθηκε από τον William Henry Perkin το 1856. Ο Perkin ήταν δεκαοκτώ ετών, εργαζόταν σε οικιακό εργαστήριο κατά τη διάρκεια των διακοπών του Πάσχα και προσπαθούσε να συνθέσει κινίνη. Αντί γι' αυτό, έλαβε ένα μαύρο υπόλειμμα, το διέλυσε και ανακάλυψε ένα χρώμα που στερεωνόταν εντυπωσιακά στο μετάξι. Το κατοχύρωσε με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας τον Αύγουστο του 1856 και έως το τέλος του 1857 διέθετε εργοστάσιο που προμήθευε ένα βαφείο μεταξιού στο Λονδίνο.

Το 1875 ο Adolf von Baeyer συνέθεσε μια κόκκινη βαφή και την ονόμασε eosin, από την Ηώ, την ελληνική λέξη για την αυγή. Το 1876 ο Heinrich Caro, τότε διευθυντής του εργαστηρίου της Badische Anilin- und Soda-Fabrik, ανέπτυξε μαζί με τον Baeyer το κυανό του μεθυλενίου ως βαφή με βάση την ανιλίνη για βαμβάκι. Η χημική δομή του δεν αποσαφηνίστηκε παρά περίπου εννέα χρόνια αργότερα.

Αυτή η προέλευση εξακολουθεί να φαίνεται στον τρόπο με τον οποίο ονομάζεται η ουσία. Το «methylene blue» είναι εμπορική ονομασία από κατάλογο βαφών και όχι χημική περιγραφή. Η ένωση στην οποία αναφέρεται είναι το χλωριούχο μεθυλοθειονίνιο, και οι διακρίσεις μεταξύ της ονομασίας, του άλατος και των ενυδατωμένων μορφών του αποκτούν σημασία μόλις κάποιος ζυγίσει το υλικό ή διαβάσει μια προδιαγραφή.

Η χρώση ήταν η γέφυρα

Η διαδρομή από τα βαφεία έως το νοσοκομείο πέρασε μέσα από το μικροσκόπιο και ξεκίνησε πριν καν υπάρξει το κυανό του μεθυλενίου. Ο Wilhelm Erb ήταν ο πρώτος που εφάρμοσε συνθετική βαφή στο αίμα, χρησιμοποιώντας πικρικό οξύ το 1865, και παρατήρησε ένα δικτυωτό μοτίβο μέσα σε ορισμένα ερυθρά αιμοσφαίρια.

Η διδακτορική διατριβή του Paul Ehrlich το 1878 συνέκρινε την ιστολογική χρώση με τη βαφή υφασμάτων και υποστήριξε ότι και οι δύο ήταν χημικές αντιδράσεις. Εργαζόμενος υπό τον Robert Koch πάνω στον βάκιλο της φυματίωσης, ταξινόμησε τις ανιλινικές βαφές σε όξινες και βασικές κατηγορίες και καθιέρωσε ότι κάθε κατηγορία χρωμάτιζε διαφορετικά μέρη ενός κυττάρου. Το 1880 ανακάτεψε τις δύο κατηγορίες: κορεσμένο διάλυμα κυανού του μεθυλενίου χυνόταν μέσα σε όξινη φουξίνη μέχρι να διαυγάσει το υπερκείμενο υγρό. Το αποτέλεσμα, το οποίο ονόμασε neutralen Farbkörper ή ουδέτερη χρώση, παρήγαγε τρία χρώματα αντί για ένα, αποκάλυψε κοκκία στα πολυμορφοπύρηνα κύτταρα που δεν ήταν ορατά προηγουμένως και κατέστησε δυνατή την πρώτη διαφορική καταμέτρηση λευκοκυττάρων. Επειδή αυτά τα κοκκία προσλάμβαναν και τα δύο συστατικά του μείγματος, ο Ehrlich επινόησε τον όρο ουδετερόφιλο για τα κύτταρα που τα έφεραν.

Δύο χρόνια αργότερα ο Koch χρησιμοποίησε κυανό του μεθυλενίου για να εντοπίσει τον βάκιλο της φυματίωσης και το 1883 ο Ehrlich βελτίωσε τη μέθοδο. Το 1886 δημοσίευσε μια διαφορετικού είδους παρατήρηση: έκανε έγχυση της βαφής σε ζωντανά ζώα, συνέκρινε πόσο έντονα την προσλάμβανε κάθε όργανο και κατέληξε στο συμπέρασμα ότι είχε έντονη συγγένεια με τον εγκέφαλο και τον νευρικό ιστό. Απέδωσε αυτή τη συγγένεια στον κύκλο οξείδωσης-αναγωγής της βαφής, τον οποίο είχε παρατηρήσει το προηγούμενο έτος. Αυτός ο κύκλος είναι επίσης ο λόγος για τον οποίο ένα διάλυμα κυανού του μεθυλενίου χάνει το χρώμα του όταν καταναλωθεί το οξυγόνο του και το ανακτά όταν επιστρέψει ο αέρας. Τα πειράματα που μέτρησαν πρώτα τις συνέπειες αυτού του κύκλου ανήκουν σε μεταγενέστερη δεκαετία, ενώ ο ίδιος ο μηχανισμός αποτελεί ξεχωριστό θέμα από την ιστορία.

Το παράσιτο και ο μοβ πυρήνας

Ο Alphonse Laveran εντόπισε το παράσιτο της ελονοσίας το 1880 εξετάζοντας φρέσκο, άχρωμο αίμα. Για να είναι ορατό συστηματικά σε αποξηραμένο επίχρισμα χρειαζόταν χρώση, και οι χρώσεις της εποχής παρήγαν μόνο κόκκινο και μπλε.

Το 1888 ο Πολωνός παθολογοανατόμος Czesław Cheçinski αντικατέστησε την όξινη φουξίνη με eosin, δημιουργώντας ένα μείγμα κυανού του μεθυλενίου και eosin. Η περίπτωση στην οποία βασίστηκε η μέθοδός του ήταν ένας στρατιώτης που είχε πεθάνει από ελονοσία στις 30 Σεπτεμβρίου 1887. Στα επιχρίσματα αίματος ο Cheçinski είδε μπλε μορφές που έμοιαζαν με μαργαρίτες, οι οποίες σήμερα αναγνωρίζονται ως Plasmodium malariae, και δρεπανοειδείς μορφές, οι οποίες σήμερα αναγνωρίζονται ως τα γαμετοκύτταρα του Plasmodium falciparum. Το αποτέλεσμα έθεσε τέλος ταυτόχρονα σε δύο ανταγωνιστικές εξηγήσεις της νόσου: τη θεωρία του μιάσματος και τον ισχυρισμό των Edwin Klebs και Corrado Tommasi-Crudeli ότι η ελονοσία προκαλούνταν από βακτήριο.

Το παράσιτο ήταν ορατό. Ο πυρήνας του δεν ήταν, γεγονός που άφηνε ανοιχτό το ερώτημα της φύσης του. Ο Ernst Malachowski, γιατρός στο Breslau, έλυσε το πρόβλημα αρχικά κατά τύχη και στη συνέχεια σκόπιμα. Το 1889 παρατήρησε διαφορική χρώση του πλασμωδιακού πυρήνα σε ένα παρασκεύασμα και δεν μπόρεσε να την αναπαραγάγει. Η οξίνιση του κυανού του μεθυλενίου δεν βοήθησε. Η αλκαλοποίησή του με βόρακα παρήγαγε το αποτέλεσμα κάθε φορά. Παρουσίασε δημόσια την τεχνική στις 15 Ιουνίου 1890 και τη δημοσίευσε το ίδιο έτος, με πληρέστερη μέθοδο τον Αύγουστο του 1891.

Ο Dmitri Romanowsky δημοσίευσε τη δική του εκδοχή τον Σεπτέμβριο του 1891. Τα καλύτερα αποτελέσματά του προήλθαν από ένα παραμελημένο, μουχλιασμένο μπουκάλι διαλύματος κυανού του μεθυλενίου ηλικίας άνω των δύο μηνών. Η περιγραφή του Malachowski ήταν σκόπιμη και, σύμφωνα με τα λόγια του, εύκολα αναπαραγώγιμη· του Romanowsky ήταν ένα αδιέξοδο που λειτούργησε μία φορά. Παρ' όλα αυτά, το επώνυμο δόθηκε στον Romanowsky, και η διαμάχη για το ποιος παρήγαγε το μοβ που έκανε ορατό τον πυρήνα είναι μια ξεχωριστή ιστορία με τα δικά της τεκμήρια.

Εικόνα: το δεύτερο διάγραμμα θερμοκρασίας από την αναφορά των Guttmann και Ehrlich του 1891. Το άνω τμήμα καλύπτει την περίοδο 13 έως 24 Ιουλίου και το κάτω τμήμα 25 Ιουλίου έως 5 Αυγούστου· οι καταχωρίσεις στο περιθώριο αναφέρουν τις δόσεις που χορηγήθηκαν και η θερμοκρασία παραμένει κοντά στο φυσιολογικό επίπεδο για τις τελευταίες τρεις εβδομάδες της καταγραφής. Αναπαραγωγή από την αναφορά όπως σαρώθηκε για τους Krafts, Hempelmann και Skórska-Stania, Parasitology Research* 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Η ωρίμανση αποδείχθηκε ότι ήταν απομεθυλίωση

Κανείς από όσους ασχολούνταν με το θέμα τη δεκαετία του 1890 δεν γνώριζε τι έκανε η «ωρίμανση» στο κυανό του μεθυλενίου. Η απάντηση προέκυψε από τη βιομηχανική χημεία. Ο Heinrich August Bernthsen είχε συνθέσει τη μητρική ένωση φαινοθειαζίνη το 1883, απέδειξε το 1885 ότι το κυανό του μεθυλενίου ανήκε σε αυτή την οικογένεια και έδειξε την ίδια περίοδο ότι οι αλκαλικές συνθήκες αφαιρούν μεθυλομάδες από τη βαφή, παράγοντας τις ενώσεις που σήμερα ονομάζονται azures.

Ο Bernard Nocht απομόνωσε το ενεργό κλάσμα το 1898 και το 1899 και μπορούσε μόνο να το ονομάσει Rot aus Methylenblau, κόκκινο από κυανό του μεθυλενίου. Ο Michaelis το ταυτοποίησε ως azure I το 1901. Ο Jenner εισήγαγε το 1899 την απόλυτη μεθανόλη ως διαλύτη για το ίζημα της βαφής, καταργώντας την ανάγκη θερμικής μονιμοποίησης των επιχρισμάτων αίματος· οι Leishman και Reuter συνδύασαν και τις δύο προόδους· ο Wright δημοσίευσε μια απλοποιημένη μέθοδο το 1902. Η συμβολή του Giemsa, επίσης το 1902, ήταν ότι έπαψε να βασίζεται σε ένα τυχαία ωριμασμένο διάλυμα και χρησιμοποίησε αντ' αυτού μετρημένες ποσότητες γνωστών βαφών. Στη συνέχεια αρνήθηκε να δημοσιεύσει πώς παρασκεύαζε καθαρό methylene azure και πούλησε τη μέθοδο στο εργαστήριο του Dr. Grübler, το οποίο διέθεσε εμπορικά το προϊόν ως azure I και ισχυρίστηκε ότι μόνο η δική του εκδοχή ήταν αυθεντική χρώση Giemsa.

Δύο παγκόσμιοι πόλεμοι ολοκλήρωσαν τη διαδικασία κατά τύχη. Όταν οι γερμανικές βαφές έγιναν δυσεύρετες, οι Lillie, Roe και Wilcox εργάστηκαν πάνω στα αμερικανικά υποκατάστατα και διαπίστωσαν ότι η καλύτερη χρώση προερχόταν από τρία διαχωρισμένα συστατικά: καθαρό κυανό του μεθυλενίου, το προϊόν διάσπασής του azure B και eosin. Αυτά τα τρία παραμένουν τα κύρια συστατικά της χρώσης που χρησιμοποιείται σήμερα για τη διάγνωση της ελονοσίας, με μια ονομασία που πλέον συνδέει τους Malachowski, Wright και Giemsa.

Εικόνα: δακτυλιοειδείς μορφές του Plasmodium falciparum* σε ανθρώπινα ερυθρά αιμοσφαίρια, χρωματισμένες με μέθοδο τύπου Romanowsky. Η μοβ δομή μέσα στον δακτύλιο είναι η χρωματίνη που το επεξεργασμένο με βόρακα κυανό του μεθυλενίου του Malachowski έκανε ορατή για πρώτη φορά. Εικόνα του Ernst Hempelmann, η οποία έχει διατεθεί στο δημόσιο τομέα.

Ένα όνομα, πολλά υλικά

Τα χρόνια που χρειάστηκαν για να διαχωριστούν αυτά τα συστατικά άφησαν ένα πρόβλημα που επέζησε περισσότερο από τη χημεία. Ο Ralph Lillie χάραξε το 1969 τη διαχωριστική γραμμή μεταξύ των βιολογικών χρώσεων, «που κατασκευάζονται σύμφωνα με αυστηρές προδιαγραφές ανάλογες με τις λεπτές και απαιτητικές χρήσεις τους», και των μη βιολογικών χρώσεων για βαφή υφασμάτων, οι οποίες «απαιτούν λιγότερο αυστηρά και απαιτητικά πρότυπα κατασκευής». Και τα δύο είδη προϊόντος έφεραν το ίδιο όνομα, και η διαφορά μεταξύ τους δεν ήταν ποτέ απλώς διαφορά βαθμού. Μια προδιαγραφή γραμμένη για βαμβάκι και μια προδιαγραφή γραμμένη για διαγνωστικό αντιδραστήριο δεν είναι εναλλάξιμες, και ένα υλικό που κατασκευάστηκε σύμφωνα με την προδιαγραφή για υφάσματα δεν προοριζόταν για κατάποση.

Το azure B είναι το σαφέστερο παράδειγμα. Είναι η μονοαπομεθυλιωμένη μορφή του κυανού του μεθυλενίου, έχει δική του μετρήσιμη φαρμακολογική δραστικότητα και υπήρχε ως μη ελεγχόμενο συστατικό σε κλινικά παρασκευάσματα κυανού του μεθυλενίου για περισσότερο από έναν αιώνα πριν κάποιος διαχωρίσει τα δύο. Μία ερευνητική ομάδα διαπίστωσε ότι ανθρώπινος ιστός που ελήφθη κατά τη νεκροψία μετά από χορήγηση κυανού του μεθυλενίου περιείχε 5 έως 14 τοις εκατό αμετάβλητο κυανό του μεθυλενίου και 86 έως 95 τοις εκατό azure B. Το αν ένα συγκεκριμένο παρασκεύασμα πρέπει να περιέχει azure B, και σε ποιο όριο, είναι ζήτημα προδιαγραφής, και η έρευνα για το azure B ως πρόσμιξη και μεταβολίτη συνεχίζει από εκεί.

Στην προδιαγραφή βρίσκεται και η πρακτική συνέπεια. Η συμμόρφωση με USP είναι η οδός προς την υψηλότερη καθαρότητα που προσφέρει η αγορά, επειδή πρόκειται για ένα πλήρες δημοσιευμένο πρότυπο δοκιμών και όχι για μία μόνο μέτρηση. Καλύπτει την ταυτότητα, την περιεκτικότητα, τις οργανικές προσμίξεις συμπεριλαμβανομένων των βαφών azure, τους υπολειμματικούς διαλύτες, τις στοιχειακές προσμίξεις, το υπόλειμμα μετά από αποτέφρωση, τα μικροβιακά όρια και τις βακτηριακές ενδοτοξίνες. Ένα πιστοποιητικό που αναφέρει αποτέλεσμα για βαρέα μέταλλα και το χαρακτηρίζει συμμόρφωση με USP έχει αναφέρει μία μόνο γραμμή από αυτή τη λίστα.

Η Blupreme προμηθεύεται το κυανό του μεθυλενίου της από φαρμακευτικό κατασκευαστή και δημοσιεύει το πλήρες πιστοποιητικό ανάλυσης, ελέγχοντας ολόκληρη την προδιαγραφή USP και όχι μόνο τα βαρέα μέταλλα. Ο οδηγός για την ανάγνωση ενός πιστοποιητικού ανάλυσης και το τι αποδεικνύει και τι δεν αποδεικνύει η ένδειξη USP εξηγούν πώς να ελέγχεται το έγγραφο σε σχέση με τον ισχυρισμό.

Τι τεκμηριώνει η ιστορία και τι όχι

Η ιστορική ακολουθία είναι πραγματική και είναι μεγαλύτερη από όσο υπονοούν οι περισσότερες σελίδες προϊόντων. Το κυανό του μεθυλενίου χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία της ελονοσίας το 1891, αναφέρθηκε ως ηρεμιστικό σε διεγερμένη ψύχωση το 1899, και η χημική του γραμμή μέσω πλευρικών αλυσίδων περνά από την quinacrine, τη chloroquine, την promethazine και την chlorpromazine. Η δημοσίευση του Ehrlich το 1890 με τον Arthur Leppmann περιέγραψε ανακούφιση από νευραλγικό και ρευματικό πόνο και στη συνέχεια εξέτασε, αλλά τελικά απέρριψε, το ενδεχόμενο δοκιμής της βαφής σε ψυχική νόσο.

Τίποτε από αυτά δεν τεκμηριώνει μια σύγχρονη χρήση. Το αποτέλεσμα για την ελονοσία το 1891 βασιζόταν σε δύο ασθενείς και ένα διάγραμμα θερμοκρασίας. Η μακρά εξοικείωση με ένα μόριο είναι λόγος για να μελετηθεί, όχι αποτέλεσμα. Η ιστορία της ένωσης ως φαρμάκου και οι σύγχρονες δοκιμές στην ελονοσία απαντούν σε διαφορετικά ερωτήματα από εκείνα που έθετε ο Ehrlich, και τα καταληκτικά σημεία πρέπει να αξιολογούνται με τους δικούς τους όρους.

Υπάρχει μία λεπτομέρεια στο ιστορικό αρχείο που ανήκει στο παρόν και όχι στο παρελθόν. Όταν ερευνητές πραγματοποίησαν δοκιμές κυανού του μεθυλενίου για την ελονοσία στην Burkina Faso τη δεκαετία του 2000, βρέθηκαν να ανταγωνίζονται για υλικό φαρμακευτικής ποιότητας και ανέφεραν ότι η τιμή της πρώτης ύλης είχε αυξηθεί κατά περίπου εκατό φορές μόλις αποκτούσε επικύρωση GMP. Μια βαφή μπορούσε να αντικατασταθεί. Ένα φάρμακο όχι. Η διάκριση που χάραξε ο Lillie το 1969 είναι η ίδια που καθορίζει τι περιέχει ένα μπουκάλι σήμερα.