Methylenblåts historie: fra tekstilfarvestof i 1876 til et lægemiddel

Methylenblåt nåede en patient, før det nåede et apotek.

Rapporten fra 1891 af Paul Guttmann og Paul Ehrlich om brugen af farvestoffet ved malaria indeholder to temperaturkurver. Den anden løber fra 13 July til 5 August, med behandlingen skrevet langs kanten dag for dag. Notaterne den 18 og 19 July lyder "1 × 0,05 Methylenblau". De følgende dage angiver fem og syv doser af samme mængde, og den 22 July er en lille mængde kinin kommet med i registreringen. Feberkurven, som svinger mellem 37 °C og 39.5 °C i den første halvdel af diagrammet, flader ud, efter at farvestoffet introduceres, og holder sig mellem cirka 36 °C og 37.5 °C i de resterende tre uger.

Patienten var en af to, beskrevet i artiklen som en tjenestekarl og en sømand. Stoffet, de fik, havde været et kommercielt tekstilfarvestof i femten år, og de to mænd er blandt de første personer, der er registreret som behandlet med et fuldt syntetisk lægemiddel rettet mod en bestemt organisme.

Farvestoffet kom først

Det første kommercielt succesfulde syntetiske farvestof blev skabt af William Henry Perkin i 1856. Perkin var atten år, arbejdede i et hjemmelaboratorium i en påskeferie og forsøgte at syntetisere kinin. I stedet fik han en sort rest, opløste den og fandt en farve, der bandt sig strålende til silke. Han tog patent på den i August 1856 og havde ved udgangen af 1857 en fabrik, der leverede til et silkefarveri i London.

I 1875 syntetiserede Adolf von Baeyer et rødt farvestof og kaldte det eosin efter Eos, det græske ord for daggry. I 1876 udviklede Heinrich Caro, som dengang var laboratoriedirektør hos Badische Anilin- und Soda-Fabrik, methylenblåt sammen med Baeyer som et anilinbaseret farvestof til bomuld. Dets kemiske struktur blev først fastlagt omkring ni år senere.

Denne oprindelse kan stadig ses i stoffets navn. "Methylenblåt" er et handelsnavn fra farvestofkataloget, ikke en kemisk beskrivelse. Stoffet, som navnet henviser til, er methylthioniniumchlorid, og forskellene mellem navnet, saltet og dets hydrater bliver relevante, så snart nogen vejer materialet eller læser en specifikation.

Farvning var forbindelsesleddet

Vejen fra farveriet til hospitalet gik gennem mikroskopet, og den begyndte, før methylenblåt fandtes. Wilhelm Erb var den første person, der anvendte et syntetisk farvestof på blod, da han brugte pikrinsyre i 1865, og han så et retikulært mønster inde i nogle røde blodlegemer.

Paul Ehrlichs doktorafhandling fra 1878 sammenlignede histologisk farvning med farvning af tekstiler og argumenterede for, at begge dele var kemiske reaktioner. Mens han arbejdede under Robert Koch med tuberkelbacillen, inddelte han anilinfarvestoffer i sure og basiske klasser og fastslog, at hver klasse farvede forskellige dele af en celle. I 1880 blandede han de to: en mættet opløsning af methylenblåt blev hældt i sur fuchsin, indtil supernatanten blev klar. Resultatet, som han kaldte neutralen Farbkörper eller neutralfarvning, frembragte tre farver i stedet for én, afslørede granula i de polymorfonukleære celler, som ikke tidligere havde været synlige, og gjorde den første differentialtælling af leukocytter mulig. Fordi disse granula optog begge komponenter i blandingen, skabte Ehrlich ordet neutrofil for de celler, der bar dem.

To år senere brugte Koch methylenblåt til at finde tuberkelbacillen, og i 1883 forbedrede Ehrlich metoden. I 1886 offentliggjorde han en anden type observation: Han injicerede farvestoffet i levende dyr og sammenlignede, hvor kraftigt hvert organ optog det, og konkluderede, at det havde en markant affinitet for hjerne- og nervevæv. Han tilskrev denne affinitet farvestoffets oxidations-reduktionscyklus, som han havde observeret året før. Denne cyklus er også årsagen til, at en opløsning af methylenblåt mister sin farve, når dens ilt forbruges, og genvinder den, når luft vender tilbage. De eksperimenter, der først målte konsekvenserne af denne cyklus, hører til et senere årti, og selve mekanismen er et særskilt emne fra historien.

Parasitten og den lilla kerne

Alphonse Laveran fandt malariaparasitten i 1880 ved at undersøge frisk, ufarvet blod. For rutinemæssigt at kunne se den i et tørret udstryg krævedes en farvning, og datidens farvemetoder frembragte kun rødt og blåt.

I 1888 erstattede den polske patolog Czesław Cheçinski sur fuchsin med eosin og frembragte en blanding af methylenblåt og eosin. Tilfældet bag hans metode var en soldat, der var død af malaria den 30 September 1887. I blodudstrygene så Cheçinski blå, margueritlignende former, som nu genkendes som Plasmodium malariae, og seglformede former, som nu genkendes som gametocytterne af Plasmodium falciparum. Resultatet satte samtidig punktum for to konkurrerende forklaringer på sygdommen: miasmeteorien og Edwin Klebs' og Corrado Tommasi-Crudelis påstand om, at malaria skyldtes en bakterie.

Parasitten var synlig. Dens kerne var ikke, hvilket lod spørgsmålet om dens natur stå åbent. Ernst Malachowski, en læge i Breslau, løste problemet først ved et tilfælde og derefter bevidst. Han bemærkede en differentieret farvning af plasmodiets kerne i et præparat i 1889 og kunne ikke reproducere den. Forsuring af methylenblåt hjalp ikke. Alkalisering med boraks frembragte effekten hver gang. Han demonstrerede teknikken offentligt den 15 June 1890 og offentliggjorde den samme år med en mere udførlig metode i August 1891.

Dmitri Romanowsky offentliggjorde sin egen version i September 1891. Hans bedste resultater kom fra en forsømt, muggen flaske med methylenblåtopløsning, der var mere end to måneder gammel. Malachowskis beskrivelse var bevidst og, med hans egne ord, let reproducerbar; Romanowskys var et blindspor, der virkede én gang. Eponymet tilfaldt alligevel Romanowsky, og striden om, hvem der frembragte den lilla farve, som gjorde kernen synlig, er en særskilt historie med sine egne dokumenter.

Figur:** det andet temperaturdiagram fra Guttmann og Ehrlichs rapport fra 1891. Det øverste panel dækker 13 til 24 July og det nederste panel 25 July til 5 August; notaterne i margenen angiver de doser, der blev givet, og temperaturen holder sig tæt på normalområdet i registreringens sidste tre uger. Gengivet fra rapporten, som den er scannet til Krafts, Hempelmann og Skórska-Stania, Parasitology Research 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Modning viste sig at være demethylering

Ingen af de involverede i 1890'erne vidste, hvad "modning" gjorde ved methylenblåt. Svaret kom fra industrikemien. Heinrich August Bernthsen havde syntetiseret moderstoffet phenothiazin i 1883, fastslået i 1885, at methylenblåt tilhørte denne familie, og i samme periode vist, at alkaliske forhold fjerner methylgrupper fra farvestoffet og danner de forbindelser, der nu kaldes azurer.

Bernard Nocht ekstraherede den aktive fraktion i 1898 og 1899 og kunne kun kalde den Rot aus Methylenblau, rødt fra methylenblåt. Michaelis identificerede den som azure I i 1901. Jenner indførte absolut methanol som opløsningsmiddel til farvestofudfældningen i 1899, hvilket fjernede behovet for at varmefiksere blodudstryg; Leishman og Reuter kombinerede begge fremskridt; Wright offentliggjorde en forenklet metode i 1902. Giemsas bidrag, også i 1902, var at holde op med at være afhængig af en tilfældigt modnet opløsning og i stedet bruge afmålte mængder af kendte farvestoffer. Derefter afslog han at offentliggøre, hvordan han fremstillede rent methylenazure, og solgte metoden til Dr. Grüblers laboratorium, som markedsførte produktet som azure I og hævdede, at kun dets version var autentisk Giemsa-farvning.

To verdenskrige fuldførte arbejdet ved et tilfælde. Da tyske farvestoffer ikke længere kunne skaffes, arbejdede Lillie, Roe og Wilcox med de amerikanske erstatninger og fandt, at den bedste farvning kom fra tre adskilte komponenter: rent methylenblåt, dets nedbrydningsprodukt azure B og eosin. Disse tre er fortsat hovedkomponenterne i den farvning, der i dag bruges til at diagnosticere malaria, under et navn, der nu samler Malachowski, Wright og Giemsa.

Figur:** ringformer af Plasmodium falciparum i menneskelige røde blodlegemer, farvet med en metode af Romanowsky-typen. Den lilla struktur inde i ringen er kromatinet, som Malachowskis boraksbehandlede methylenblåt gjorde synligt for første gang. Billede af Ernst Hempelmann, frigivet til public domain.

Ét navn, flere materialer

De år, der gik med at adskille disse komponenter, efterlod et problem, som overlevede selve kemien. Ralph Lillie trak i 1969 grænsen mellem biologiske farvestoffer, "fremstillet efter strenge specifikationer svarende til deres følsomme og krævende anvendelser", og ikke-biologiske farvestoffer til tekstilfarvning, som "kræver mindre strenge og krævende fremstillingsstandarder". Begge typer produkter bar samme navn, og forskellen mellem dem var aldrig blot et spørgsmål om grad. En specifikation skrevet til bomuld og en specifikation skrevet til et diagnostisk reagens kan ikke bruges i stedet for hinanden, og et materiale fremstillet efter tekstilspecifikationen var ikke beregnet til at blive indtaget.

Azure B er den tydeligste illustration. Det er den monodemethylerede form af methylenblåt, det har målbar farmakologisk aktivitet i sig selv, og det fandtes som en ukontrolleret bestanddel af kliniske præparater med methylenblåt i mere end et århundrede, før nogen adskilte de to. En gruppe fandt, at menneskeligt væv udtaget ved obduktion efter administration af methylenblåt indeholdt 5 til 14 procent uændret methylenblåt og 86 til 95 procent azure B. Om et givet præparat bør indeholde azure B, og ved hvilken grænse, er et specifikationsspørgsmål, og forskningen i azure B som urenhed og metabolit fortsætter derfra.

Det er også i specifikationen, den praktiske konsekvens ligger. Overensstemmelse med USP er vejen til den højeste renhed, markedet tilbyder, fordi det er en komplet offentliggjort teststandard og ikke en enkelt måling. Den omfatter identitet, indholdsbestemmelse, organiske urenheder inklusive azure-farvestofferne, restopløsningsmidler, elementære urenheder, gløderest, mikrobielle grænser og bakterielle endotoksiner. Et certifikat, der angiver et resultat for tungmetaller og kalder det USP-overensstemmelse, har kun rapporteret én linje på denne liste.

Blupreme får sit methylenblåt fra en farmaceutisk producent og offentliggør det fulde analysecertifikat, hvor hele USP-specifikationen testes i stedet for kun tungmetaller. Vejledningen til at læse et analysecertifikat og hvad USP-betegnelsen fastslår og ikke fastslår gennemgår, hvordan dokumentet kontrolleres i forhold til påstanden.

Hvad historien giver belæg for, og hvad den ikke gør

Udviklingslinjen er reel, og den er længere, end de fleste produktsider antyder. Methylenblåt blev brugt til behandling af malaria i 1891, blev rapporteret som et sedativ ved agiteret psykose i 1899, og dets sidekæde går igen i quinacrin, chloroquin, promethazin og chlorpromazin. Ehrlichs artikel fra 1890 sammen med Arthur Leppmann beskrev lindring af neuralgiske og reumatiske smerter og overvejede derefter, men afstod fra, at teste farvestoffet ved psykisk sygdom.

Intet af dette fastslår en moderne anvendelse. Malariaresultatet fra 1891 omfattede to patienter og et temperaturdiagram. Lang tids kendskab til et molekyle er en grund til at undersøge det, ikke et resultat. Historien om stoffet som lægemiddel og moderne forsøg ved malaria besvarer andre spørgsmål end dem, Ehrlich stillede, og endepunkterne skal læses på deres egne præmisser.

Der er én detalje i materialet, som hører nutiden til snarere end fortiden. Da forskere gennemførte malariaforsøg med methylenblåt i Burkina Faso i 2000'erne, måtte de konkurrere om materiale i farmaceutisk kvalitet og rapporterede, at prisen på råmaterialet var steget med en faktor på omkring hundrede, så snart det havde GMP-validering. Et farvestof kunne erstattes. Et lægemiddel kunne ikke. Den sondring, Lillie foretog i 1969, er den samme, som afgør, hvad en flaske indeholder i dag.