Forsøgene, der knyttede methylenblåt til cellerespiration

Defibrineret humant blod, opvarmet til 37 °C i tre timer, forbruger omkring to procent af den ilt, det indeholder. Tilsæt en lille mængde methylenblåt før inkubationen, og det samme blod forbruger omkring femogtres procent. Intet ved cellerne ændrede sig. Kun opløsningen gjorde.

Tallet stammer fra en artikel fra 1928 af George Harrop og E. S. Guzman Barron ved Johns Hopkins, og det er ophavet til den ofte gentagne påstand om, at methylenblåt forbedrer cellerespirationen. Påstanden er ikke forkert, men den er mere snæver, end den lyder.

Hvad tallet i tabellen faktisk måler

Endepunktet var iltoptagelse, bestemt ved gasanalyse. Harrop og Barron filtrerede friskudtaget blod gennem vat ved 10 °C for at fjerne de hvide blodlegemer, mættede prøven med ilt, delte den, tilsatte farvestof til den ene del og analyserede begge efter inkubation. Leukocyttallet oversteg sjældent omkring tusind pr. kubikmillimeter. Iltforbruget blev angivet som den andel af prøvens oprindelige iltindhold, der var forsvundet.

De målte også kuldioxid, og her gav metoden problemer. Defibrineret blod frigav op til to millimol kuldioxid pr. 100 mL i den første times inkubation af årsager, der ikke havde noget med den undersøgte reaktion at gøre, så respiratoriske kvotienter fra fuldblod var ubrugelige. Kun vaskede celler i Lockes opløsning gav tal, der kunne fortolkes, og de lå mellem 0.73 og 0.80 med og uden farvestoffet.

Den detalje er ikke en bagatel. »Respiration« betyder i disse artikler gasudveksling i en lukket beholder. Forskellen mellem iltforbrug og nyttig energiproduktion undersøges særskilt i hvad iltforbrug fortæller og ikke fortæller om ATP.

Farvestoffet bidrog mest, hvor cellerne respirerede mindst

Modne erytrocytter fra pattedyr har næsten intet målbart iltforbrug. Fugles kerneholdige erytrocytter har derimod et målbart iltforbrug. Harrop og Barron undersøgte begge, og kontrasten er kernen i deres argument.

I prøverne fra pattedyr gav farvestoffet stigninger på tyve til halvtreds gange. I gåseblod, hvis celler allerede respirerede, blev hastigheden aldrig mere end fordoblet. Jo højere respirationen var fra starten, desto mindre kunne farvestoffet bidrage med.

Den samme gradient ses inden for én art. En human prøve fra en patient med polycythaemia vera, som indeholdt umodne celler, forbrugte 11.3 procent af sin ilt uden farvestof mod 2.8 procent for vaskede celler fra en rask donor. Farvestoffet bragte kun tallet op på 63.4 procent, en seksdobling, hvor normale celler viste en næsten tredive gange højere hastighed. Farvestoffet fik modne celler til at opføre sig mere som umodne celler, hvilket var det, forfatterne sagde, at det gjorde.

Cyanid burde have stoppet det

Man vidste, at cyanid stoppede cellulær oxidation. Harrop og Barron tilsatte det alligevel sammen med farvestoffet.

Resultaterne fra kvægblod er repræsentative. Iltindholdet faldt fra 22.61 til 22.03 volumenprocent over tre timer uden tilsætninger. Med methylenblåt faldt det til 12.84. Med methylenblåt og kaliumcyanid i en koncentration på en femtusindedel molar faldt det til 12.74. Farvestoffets effekt var stort set uændret.

Figur: en kontinuerlig mikrorespirationsregistrering af humane erytrocytter. Pilen markerer tilsætningen af methylenblåt. Før den er kurven næsten flad; bagefter stiger den støt. Gengivet fra Harrop og Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Deres konklusion var, at farvestoffet virkede som en iltbærer, »der tilfører et stof, som er forsvundet fra modne, kerneløse erytrocytter hos pattedyr«. To år senere gav Michaelis og Salomon ved Rockefeller Institute uenigheden dens blivende form. Enten var farvestoffets effekt »en tilfældig egenskab ved farvestoffet«, eller også var farvestoffet »en model for et ukendt stof i organismerne«. De to muligheder er stadig ikke afklaret. Det, der har ændret sig, er, at cellerne nu kan beskrives langt mere præcist.

Et leverekstrakt gjorde det samme

Michaelis og Salomon viste, at koldtvandsekstrakter af organer gav den samme stimulering. Rottelever havde den stærkeste effekt, efterfulgt af nyre, milt og testikel. Hjerne, muskel og blodserum havde ringe eller ingen effekt.

Derefter testede de ekstraktet med kulmonoxid. Respiration fremkaldt af enten ekstraktet eller farvestoffet var uændret i en blanding af 98 procent kulmonoxid og 2 procent ilt. Den samme gasblanding hæmmede respirationen i gær og i kerneholdige erytrocytter fra høns med omkring 60 til 80 procent, i overensstemmelse med Warburgs beskrivelse af et kulmonoxidfølsomt respirationsferment. Det uidentificerede stof fra vævet var derfor ikke Warburgs enzym.

Flere mulige identiteter blev udelukket undervejs. Reduceret glutathion og cystein gav kun det iltforbrug, som deres egen oxidation krævede. Harden og Youngs coenzym blev udelukket, fordi muskel indeholder mest af det og udviste næsten den mindste effekt. Keilins cytokrom, som var blevet navngivet få år tidligere, stødte på den samme modsigelse. Deres eget forslag om, at det aktive stof kom fra cellekernen, kaldte de blot et forslag.

Effekten var betinget

Cellerne skulle være intakte. Hæmolyse ved hjælp af destilleret vand eller gentagen nedfrysning fjernede responsen på både farvestoffet og ekstraktet, og delvis hæmolyse reducerede den tilsvarende.

Sukker var også nødvendigt. Glukose, fruktose og sukrose understøttede den farvestofinducerede respiration; mannitol gjorde ikke. Uden sukker var der slet ingen respiration, og farvestoffet så ud til at beskadige cellerne undervejs, så glukose tilsat en eller to timer senere ikke genoprettede den. Forfatterne foreslog, at farvestoffet oxiderede en strukturel bestanddel, som cellen havde brug for.

Belysning øgede farvestoffets effekt betydeligt, selv om effekten også var tydelig i mørke. Andre reducerbare farvestoffer opførte sig anderledes: toluylenblåt matchede eller overgik methylenblåt, mens indigodisulfonat næsten ingen effekt havde. Der fremkom ingen klar sammenhæng mellem et farvestofs oxidations-reduktionspotentiale og størrelsen af dets effekt, hvilket forfatterne tilskrev membranpermeabilitet og toksicitet.

Effekten fulgte fermenteringen, ikke respirationen

Barrons studie fra 1930 gik fra cellesuspensioner til vævssnit af normale rotteorganer og transplanterede tumorer.

I væv uden aerob glykolyse havde methylenblåt ingen effekt eller hæmmede iltforbruget en smule: nyre med omkring 14 procent, bugspytkirtel med omkring 14 procent og lever med omkring 5 procent. I væv, der fermenterer i nærvær af ilt, øgede det forbruget: milt med omkring 8 procent og hjerne med omkring 13 procent. Stigningerne i tumorer spændte fra omkring 27 procent i et humant brystkarcinom til mere end 80 procent i et Rous-sarkom hos kyllinger, omtrent i forhold til hvert vævs aerobe glykolyse.

Figur: hvert punkt er én vævstype. Den vandrette akse viser aerob glykolyse; den lodrette akse viser ændringen i iltforbrug efter tilsætning af methylenblåt. Data fra Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), tabel 6, PMID 19869777.

Cyanidforsøget gav derefter det omvendte billede. Når respirationen i de væv, som tidligere ikke havde reageret, blev blokeret med cyanid, og fermenteringen blev tydelig, øgede farvestoffet igen iltforbruget: nyre med omkring 59 procent, lever med omkring 19 procent, milt med omkring 286 procent og testikel med omkring 200 procent.

Barron foreslog, at farvestoffet kunne bruges som en test af en celles eller et vævs fermenteringsevne, og sluttede med en spekulation: dyrkning af tumorer gennem flere generationer i et farvestofholdigt medium kunne måske en dag få en tumors stofskifte til varigt at ligne normalt vævs. Det var et forskningsspørgsmål formuleret i 1930. Det er ikke en påstand om behandling.

Hvad forsøgene ikke kan have målt

I 1928 og 1930 betød »respiration« iltforbrug. Adenosintrifosfat blev først beskrevet i 1929, og påvisningen af, at isolerede mitokondrier esterificerer fosfat, mens de overfører elektroner, kom i 1949. Ingen af de tidlige artikler om methylenblåt kunne have målt energiproduktion, og ingen af dem hævdede at gøre det.

Cellerne er det andet problem. Modne erytrocytter fra pattedyr indeholder ingen mitokondrier. Under retikulocytstadiet fjerner de mitokondrier og ribosomer ved selektiv autofagi, og derfor drives et modent rødt blodlegeme af glykolyse og er hovedsageligt afhængigt af pentosefosfatvejen for NADPH snarere end for ATP. I forsøgene fra 1928 var der ingen elektrontransportkæde til stede, som kunne repareres. Det, der forbrugte ilten, gjorde noget andet.

Hvad dette andet var, er nu rimeligt godt beskrevet. Methylenblåt optager elektroner fra cellulære reduktionsækvivalenter og bliver til leukomethylenblåt, som reoxideres af molekylært ilt og dermed slutter cyklussen. I humane røde blodlegemer udfører NADPH-afhængig flavinreduktase og beslægtede disulfidreduktaser reduktionstrinnet. Et studie fra 1976 med mærket glukose viste, at farvestoffet stimulerer hexosemonofosfatshunten, at effekten ved lav koncentration afhang af oxyhæmoglobin, og at en højere koncentration, 0.1 mM, dannede hydrogenperoxid. Et reduceret farvestof, der møder ilt, danner peroxid, ikke fosfatbindinger.

I mitokondrier er billedet mere omdiskuteret, end de populære sammenfatninger giver indtryk af. Én forskningsretning hævder, at farvestoffet tager elektroner fra området omkring kompleks I og giver dem videre til cytokrom c. En anden fandt, at det i mitokondrier fra musehjerner ikke kan genoprette respirationen efter en blokering med antimycin, og placerede i stedet elektronacceptoren ved ubiquinolbindingsstedet i kompleks III. En tredje fandt, at lave koncentrationer øgede iltforbruget i hvile uden at ændre den ADP-stimulerede respiration. Den mest direkte formulering af pointen er, at iltforbrug fremkaldt af methylenblåt slet ikke afhænger af oxidativ fosforylering: det fortsatte, når respirationskæden var hæmmet, og i præparationer uden en sådan kæde.

Der findes også direkte målinger af forskellen mellem de to størrelser. I isolerede mitokondrier fra rottelever sænkede stigende farvestofkoncentrationer de respiratoriske kontrolforhold og forårsagede opsvulmning, hvilket forfatterne beskrev som afkobling af oxidativ fosforylering. I perfunderet rottelever øgede methylenblåt iltforbruget, mens forholdet mellem ATP og ADP faldt.

De kliniske erfaringer giver det samme budskab. Methæmoglobinæmi behandles med omkring et til to milligram methylenblåt pr. kilogram intravenøst via en NADPH-afhængig reduktionsvej, og større doser fremkalder den tilstand, der behandles. Den samme oversigtsartikel bemærker, at virkningen som antidot er størst i intakte erytrocytter og svækkes ved hæmolyse, hvilket er fundet om hæmolyse fra 1930, der dukker op igen treoghalvfjerds år senere i en hospitalskontekst. Et stof, hvis gavnlige og skadelige virkninger ligger på hver sin side af en dosistærskel, er ikke et stof, hvis dosis bør udledes af en måling af iltforbrug.

Hvorfor batchen hører med i diskussionen

Harrop og Barron bemærkede noget, der er værd at læse igen. Methylenblåt frembringer selv et bånd i spektroskopet mellem methæmoglobins to karakteristiske bånd, »hvilket let kan skabe forvirring ved en overfladisk undersøgelse«. Farvestoffet kan efterligne det stof, man leder efter.

Det samme problem har en kemisk form. Et beslægtet phenothiazin, der er til stede som en mindre bestanddel, har sin egen redoxadfærd, sin egen permeabilitet og sin egen toksicitet. Et dokumenteret tilfælde gør betydningen konkret: I et studie af jodering af methylenblåt dannede prøver med omkring 7 til 8 procent Azure B hovedsageligt joderet Azure B, så urenheden snarere end methylenblåt dominerede reaktionen.

Enhver, der bruger methylenblåt som reagens, i et laboratorium, ved en farvebænk eller i et akvarium, arbejder med en uspecificeret bestanddel, medmindre batchen er blevet karakteriseret. Beslægtede stoffer, identitet, elementære urenheder, rester af opløsningsmidler og gløderest er en del af forsøget snarere end papirarbejde omkring det. Blupreme får sit methylenblåt fra en lægemiddelproducent og offentliggør et fuldt analysecertifikat med test af hele USP-specifikationen frem for kun tungmetaller; vejledningen til at læse et analysecertifikat og hvad betegnelsen USP-kvalitet fastslår og ikke fastslår beskriver, hvordan dokumentet kan kontrolleres i forhold til påstanden.

Tallet var rigtigt

Forsøgene fra 1928 og 1930 var omhyggelige, og deres centrale observation har holdt: Et reducerbart farvestof kan få en celle, der næsten ikke respirerer, til at forbruge ilt med en hastighed, der er mange gange højere end i hvile, uden at gå gennem det trin, som cyanid blokerer.

Fejlen opstår senere, når »respiration« læses i sin moderne betydning. En måling af gasudveksling fortæller, at elektroner nåede frem til ilt. Den fortæller ikke, at nogen af dem blev brugt til at danne ATP, og i en celle uden mitokondrier er afstanden mellem de to udsagn så stor, som den kan blive. Det bredere overblik over, hvad methylenblåt gør i celler sætter den samme sondring ind i en større sammenhæng, og stoffets historie fra farvestof til lægemiddel forklarer, hvordan et tekstilfarvestof overhovedet fandt vej til disse forsøg.