Hvordan virker methylenblåt? Redoxkemi og mekanismer

En kolbe med prop på et laboratoriebord er den korteste ærlige introduktion til, hvordan methylenblåt virker. Vand, glukose, en knivspids natriumhydroxid og nok farvestof til at gøre væsken dyb og umiskendeligt blå. Vent et par minutter, og det blå forsvinder, indtil kolben ligner en kolbe med vand. Ryst den, og farven vender straks tilbage. Så falmer den igen, og det fortsætter, så længe der er glukose, som er villig til at afgive elektroner, og oxygen, som er villig til at modtage dem.

Intet ved farvestoffet har ændret sig bortset fra antallet af elektroner, det bærer. Oxideret er det blåt. Reduceret er det ikke. Næsten alt andet i den terapeutiske litteratur og forskningslitteraturen om dette molekyle følger af dette ene reversible trin, fordi et molekyle, der kan tage elektroner fra én partner og give dem videre til en anden, er et relæ, og et relæ gør intet på egen hånd. Hvad det gør, afhænger fuldstændigt af, hvad der befinder sig i hver ende.

To former, og hvorfor parret er vigtigt

Den oxiderede form er et plant, positivt ladet ringsystem. Den flade, ladede form er grunden til, at det stabler sig mod nukleinsyrer, binder til sialylerede strukturer på cellemembraner og absorberer synligt lys kraftigt mellem cirka 600 og 700 nanometres, som er den del af spektret, det menneskelige øje opfatter som blåt.

Den reducerede form er noget andet. Den har ingen ladning, den opløses i fedt snarere end vand, og den er farveløs. Dens ionisering er meget lav ved pH-værdien inde i kroppen, i størrelsesordenen nogle få per cent. Derfor krydser det reducerede molekyle let en cellemembran ved diffusion, og når det først er inde, hvor miljøet er mere oxiderende, kan det reoxideres og i praksis blive fanget. Det oxiderede ringsystem er fladt; det reducerede kan vride sig. Disse strukturelle konsekvenser og selve farveændringen hører til historien om de to former i sig selv, og de behandles mere detaljeret i sammenligningen af methylenblåt og leukomethylenblåt.

Modtagelse af elektroner

Det oxiderede farvestof modtager elektroner fra en lang række donorer. Glukose i demonstrationskolben er én af dem. Inde i en celle er reducerede pyridinnukleotider og komponenter i mitokondriernes elektrontransportkæde andre. Når methylenblåt reduceres i væv, der indeholder oxygen, forbruger den cyklus, det etablerer, både reduktionsmidlet og oxygen og producerer reaktive oxygenforbindelser, primært hydrogenperoxid. Farvestoffet kommer uændret ud af cyklussen igen, klar til at gennemføre den på ny.

Det sidste punkt forklarer en modstrid, som ellers kan se sjusket ud. Methylenblåt beskrives i litteraturen både som prooxidant og antioxidant, og begge beskrivelser kan forsvares. Det kan hæmme produktionen af superoxid ved at fungere som en kunstig elektronacceptor og lede elektronstrømmen væk fra de enzymsteder, hvor oxygen ellers ville blive omdannet til superoxidradikaler. I levercellekulturer er det blevet vist, at det inducerer fase-2-antioxidantforsvarsenzymer, herunder thioredoxinreduktase 1 og NADPH-quinonoxidoreduktase. Hvilken af de to sider man ser, afhænger af, hvilken ende af relæet der mangler elektroner på det pågældende tidspunkt. Et spørgsmål som "er methylenblåt en antioxidant" er ikke veldefineret, før man angiver i hvilket system, ved hvilken koncentration og med hvilke andre stoffer til stede.

Videregivelse af elektroner

Når farvestoffet først holder en ekstra elektron, kan tre meget forskellige ting ske derefter, og de beskrives som regel under én overskrift. Det bør de ikke.

Det kan overføre elektronen til et metalcenter. Det tydeligste tilfælde er hæmoglobin, der er blevet oxideret fra ferro- til ferritilstanden. I denne tilstand kan det ikke transportere oxygen. I røde blodlegemer reducerer et enzym farvestoffet, hvorefter det reducerede farvestof ikke-enzymatisk overfører elektroner til det oxiderede hæmjern, så fungerende hæmoglobin gendannes, og farvestoffet vender tilbage til sin oxiderede form. Farvestoffet forbruges ikke i processen; det cirkulerer. Det kliniske billede, der bygger på denne reaktion, hører hjemme på hospitalet, og forklaringen på methylenblåt ved methemoglobinæmi beskriver, hvordan det anvendes, og hvorfor det overvåges så tæt.

En præcis bemærkning om kilderne: De to oversigtsartikler, som denne artikel bygger på, angiver ikke den samme reducerende cofaktor for enzymtrinnet; den ene angiver NADH og den anden NADPH. Uenigheden er reel og ikke afklaret i de kilder, der er tilgængelige her, så den sikre beskrivelse er den rolle, hver del spiller, frem for navnet på én bestemt cofaktor.

Det kan overføre energi eller en elektron til oxygen, hvis der er lys. Denne vej findes kun under belysning. Det exciterede farvestof når en triplettilstand, og derfra er to mekanismer mulige. I den første interagerer det exciterede farvestof direkte med et nabomolekyle ved at optage hydrogen eller overføre en elektron, hvilket danner radikaler; en sådan reaktion med vand producerer hydroxylradikaler. I den anden overføres excitationsenergien til selve oxygenet, hvilket danner singlet-oxygen, en stærkt elektrofil forbindelse, der henfalder inden for microseconds, og som generelt accepteres som den vigtigste vej, hvorved belyst methylenblåt beskadiger mikrobielle celler. Reaktioner med lipider og peptider i cellehylsteret samt med guaninbaser i DNA er blandt de dokumenterede resultater.

Den praktiske konsekvens af denne vej er, at belysning ændrer tallene med størrelsesordener. I de data, som Wainwright og Crossley indsamlede, har methylenblåt mod Pseudomonas aeruginosa en minimal baktericid koncentration på omkring 500 micromolar i mørke og omkring 25 micromolar ved en lysdosis på 12 joules per square centimetre. Mod én stamme af Staphylococcus aureus er værdierne i mørke og under belysning begge 5 micromolar. Med andre ord er spørgsmålet om, hvorvidt molekylet overhovedet fungerer som et antimikrobielt middel, ikke en egenskab ved molekylet alene; det er en egenskab ved molekylet plus lyset.

Det kan virke direkte på et enzymsted uden relæet. Methylenblåt oxiderer det ferrojern, der er bundet til nitrogenoxidsyntase, hvilket inaktiverer enzymet. Det blokerer opløselig guanylatcyklase, og mellem 1 og 10 micromolar er den rutinemæssige laboratoriekoncentration, der bruges til dette formål. Det hæmmer monoaminoxidase type A med en IC50 mellem 27 og 180 nanomolar, hvilket er mekanismen bag den veldokumenterede interaktion med serotoningenoptagelseshæmmere og grunden til, at lægemiddelinteraktioner med methylenblåt udgør en kategori for sig.

Disse tre veje er kemisk forskellige. At slå dem sammen til én enkelt påstand om, at methylenblåt virker gennem redoxcykling, er hovedårsagen til, at så meget tekst om stoffet fremstår både sikker og vag på samme tid.

Fire skel, der afgør, om en mekanismebeskrivelse betyder noget

Hvilken form. Det reducerede farvestof kan ikke uden videre sidestilles med det oxiderede farvestof. Hæmning af acetylcholinesterase illustrerer fælden: Under en lang in vitro-inkubation reduceres methylenblåt gradvist til sin farveløse form, og hæmningen aftager, fordi det reducerede molekyle ikke hæmmer dette enzym. Et assay, der kører længe nok til at ændre formen, vil rapportere en svagere effekt og invitere til den forkerte forklaring.

Hvilken koncentration. Laboratorieintervallet for hæmning af opløselig guanylatcyklase er 1 til 10 micromolar. Det krævede 5 til 50 micromolar at ophæve glutamatmedieret transmission i hippocampusskiver fra rotter. Toksiske effekter i cellekultur rapporteres over 100 micromolar. Det er ikke det samme eksperiment, og en mekanisme, der er bekræftet ved 50 micromolar, er ikke automatisk til stede hos en patient, hvis plasmakoncentration kun er en brøkdel af dette.

Hvilken administrationsvej. Den absolutte orale biotilgængelighed er omkring 72 per cent, og den terminale plasmahalveringstid er 5 til 7 hours. Oral administration giver højere koncentrationer i tarm og lever; intravenøs administration giver højere koncentrationer i hjernen. Administrationsvejen afgør, hvilket væv elektronerne møder.

Hvilken model, og om lyset var tændt. En stor del af den mekanistiske litteratur bygger på cellekulturer og gnaverforsøg, og in vitro-resultater for dette molekyle afhænger af lyseksponering, membranpotentiale og cellernes redoxtilstand, fordi en mikroskoplampe er tilstrækkelig til at fotosensibilisere det. Mellem 65 og 85 per cent af en administreret dosis reduceres til den farveløse form i røde blodlegemer og perifert væv. Hver eneste af disse variabler befinder sig mellem en klar mekanisme i en laboratorieskål og en påstand om et menneske.

Hvorfor spørgsmålet om renhed er et spørgsmål om kemi

Belysning demethylerer methylenblåt. Det første produkt er Azure B, derefter Azure A og derefter thionin, og højere lysintensitet giver mere nedbrydning end lavere. Et molekyle, hvis anvendelighed består i at kunne modtage og afgive elektroner, er derfor også et molekyle, hvis sandsynlige nedbrydningsprodukter er nært beslægtede kemiske forbindelser, som forbliver i den samme opløsning. Sammensætningen af det, der befinder sig i beholderen, er ikke en kosmetisk detalje.

Det er grunden til, at overensstemmelse med USP-specifikationen er den relevante test for en køber. Et produkt, der ikke opfylder den, er et farvestof, og et farvestof indeholder urenheder, herunder Azure B, tungmetaller og restopløsningsmidler, som en person, der indtager det, ikke ønsker. Den yderligere fælde er en sælger, der kun tester for tungmetaller og præsenterer resultatet som fuld overensstemmelse. Blupreme har indgået partnerskab med en farmaceutisk producent af methylenblåt og tester hele specifikationen: identitet, renhed, organiske urenheder, restopløsningsmidler, elementære urenheder, rest ved antænding, mikrobielle grænser og bakterielle endotoksiner. Laboratorietestdokumentet bag hvert batch offentliggøres, og valg af leverandør handler i høj grad om at kontrollere, om dette dokument findes, og hvad det dækker.

Ét reversibelt par. Flere veje ud af det. Vejen afgør, hvad påstanden kan være.