Hanes glas methylen: o liw i feddygaeth ac ymchwil

Cyrhaeddodd glas methylen glaf cyn iddo gyrraedd fferyllfa.

Mae adroddiad 1891 gan Paul Guttmann a Paul Ehrlich ar ddefnyddio'r lliw mewn malaria yn cynnwys dau siart tymheredd. Mae'r ail yn rhedeg o 13 Gorffennaf i 5 Awst, gyda'r driniaeth wedi'i hysgrifennu ar hyd yr ymyl o ddydd i ddydd. Mae'r cofnodion ar 18 a 19 Gorffennaf yn darllen "1 × 0,05 Methylenblau". Mae'r dyddiau canlynol yn rhestru pump a saith dos o'r un faint, ac erbyn 22 Gorffennaf mae ychydig bach o gwinîn wedi ymuno â'r cofnod. Mae'r llinell dwymyn, sy'n siglo rhwng 37 °C a 39.5 °C ar draws hanner cyntaf y siart, yn gwastatáu ar ôl i'r lliw ymddangos ac yn aros rhwng tua 36 °C a 37.5 °C am y tair wythnos sy'n weddill.

Roedd y claf yn un o ddau, a ddisgrifiwyd yn y papur fel gwas domestig a morwr. Roedd y cyfansoddyn a gawsant wedi bod yn lliw tecstilau masnachol am bymtheg mlynedd, ac mae'r ddau ddyn ymhlith y bobl gyntaf a gofnodwyd fel rhai a gafodd eu trin â chyffur cwbl synthetig wedi'i anelu at organeb benodol.

Daeth y lliw yn gyntaf

Crëwyd y lliw synthetig cyntaf a oedd yn fasnachol lwyddiannus gan William Henry Perkin ym 1856. Roedd Perkin yn ddeunaw oed, yn gweithio mewn labordy cartref yn ystod gwyliau'r Pasg, ac yn ceisio syntheseiddio cwinîn. Yn lle hynny cafodd weddillion du, eu hydoddi, a darganfod lliw a oedd yn glynu'n wych wrth sidan. Cafodd batent arno ym mis Awst 1856 ac erbyn diwedd 1857 roedd ganddo ffatri'n cyflenwi gwaith lliwio sidan yn Llundain.

Ym 1875 syntheseiddiodd Adolf von Baeyer liw coch a'i enwi'n eosin, o Eos, y gair Groeg am y wawr. Ym 1876 datblygodd Heinrich Caro, a oedd bryd hynny'n gyfarwyddwr y labordy yn Badische Anilin- und Soda-Fabrik, las methylen gyda Baeyer fel lliw wedi'i seilio ar anilin ar gyfer cotwm. Ni chafodd ei strwythur cemegol ei bennu'n derfynol tan tua naw mlynedd yn ddiweddarach.

Mae'r tarddiad hwnnw'n dal i'w weld yn enw'r sylwedd. Enw masnach o'r catalog lliwiau yw "glas methylen", nid disgrifiad cemegol. Y cyfansoddyn y mae'n cyfeirio ato yw methylthioninium chloride, ac mae'r gwahaniaethau rhwng yr enw, yr halen, a'i hydradau yn bwysig cyn gynted ag y bydd rhywun yn pwyso'r deunydd neu'n darllen manyleb.

Staenio oedd y bont

Roedd y llwybr o'r gweithfeydd lliwio i'r ysbyty'n mynd drwy'r microsgop, a dechreuodd cyn bod glas methylen yn bodoli. Wilhelm Erb oedd y person cyntaf i roi lliw synthetig ar waed, gan ddefnyddio asid picrig ym 1865, a gwelodd batrwm rhwydog y tu mewn i rai celloedd coch.

Cymharodd traethawd doethuriaeth Paul Ehrlich ym 1878 staenio histolegol â lliwio tecstilau a dadleuodd fod y ddau yn adweithiau cemegol. Wrth weithio o dan Robert Koch ar y basilws twbercwl, dosbarthodd liwiau anilin yn ddosbarthiadau asidig a basig a sefydlodd fod pob dosbarth yn lliwio rhannau gwahanol o gell. Ym 1880 cymysgodd y ddau: tywalltwyd hydoddiant dirlawn o las methylen i mewn i fuchsin asid nes i'r uwchnofyn glirio. Cynhyrchodd y canlyniad, a alwodd yn neutralen Farbkörper neu'n staen niwtral, dri lliw yn lle un, datgelodd ronynnau yn y celloedd polymorffoniwclear nad oeddent wedi bod yn weladwy o'r blaen, a gwnaeth y cyfrif gwahaniaethol cyntaf o leukocytau yn bosibl. Gan fod y gronynnau hynny'n amsugno dwy gydran y cymysgedd, bathodd Ehrlich y gair neutrophil ar gyfer y celloedd a oedd yn eu cario.

Ddwy flynedd yn ddiweddarach defnyddiodd Koch las methylen i ddod o hyd i'r basilws twbercwl, ac ym 1883 gwellodd Ehrlich y dull. Ym 1886 cyhoeddodd arsylwad o fath gwahanol: chwistrellodd y lliw i anifeiliaid byw a chymharodd pa mor gryf yr oedd pob organ yn ei amsugno, a daeth i'r casgliad fod ganddo affinedd amlwg at feinwe'r ymennydd a'r nerfau. Priodolodd yr affinedd hwnnw i gylchu ocsidiad-gostyngiad y lliw, yr oedd wedi'i arsylwi y flwyddyn flaenorol. Y cylchu hwnnw hefyd sy'n esbonio pam mae hydoddiant glas methylen yn colli ei liw pan gaiff ei ocsigen ei ddefnyddio ac yn ei adennill pan fydd aer yn dychwelyd. Mae'r arbrofion a fesurodd ganlyniadau'r cylchu hwnnw am y tro cyntaf yn perthyn i ddegawd diweddarach, ac mae'r mecanwaith ei hun yn bwnc ar wahân i'r hanes.

Y parasit a'r cnewyllyn porffor

Daeth Alphonse Laveran o hyd i'r parasit malaria ym 1880 drwy archwilio gwaed ffres heb ei staenio. Er mwyn ei weld yn rheolaidd mewn taeniad sych roedd angen staen, ac roedd staeniau'r cyfnod yn cynhyrchu coch a glas yn unig.

Ym 1888 disodlodd y patholegydd Pwylaidd Czesław Cheçinski fuchsin asid ag eosin, gan gynhyrchu cymysgedd o las methylen ac eosin. Roedd yr achos y tu ôl i'w ddull yn ymwneud â milwr a fu farw o falaria ar 30 Medi 1887. Yn y ffilmiau gwaed gwelodd Cheçinski ffurfiau glas tebyg i lygad y dydd, sydd bellach yn cael eu hadnabod fel Plasmodium malariae, a ffurfiau siâp cryman, sydd bellach yn cael eu hadnabod fel gametocytau Plasmodium falciparum. Rhoddodd y canlyniad derfyn ar ddau esboniad cystadleuol o'r clefyd ar unwaith: damcaniaeth y miasma, a'r honiad gan Edwin Klebs a Corrado Tommasi-Crudeli fod malaria'n cael ei achosi gan facteriwm.

Roedd y parasit yn weladwy. Nid oedd ei gnewyllyn, a oedd yn gadael ei natur yn agored. Datrysodd Ernst Malachowski, meddyg yn Breslau, y broblem honno ar ddamwain ac yna'n fwriadol. Sylwodd ar staenio gwahaniaethol o gnewyllyn y plasmodiwm mewn paratoad ym 1889 ac ni allai ei atgynhyrchu. Nid oedd asideiddio'r glas methylen yn helpu. Roedd ei alcalineiddio â boracs yn cynhyrchu'r effaith bob tro. Dangosodd y dechneg yn gyhoeddus ar 15 Mehefin 1890 a'i chyhoeddi yr un flwyddyn, gyda dull manylach ym mis Awst 1891.

Cyhoeddodd Dmitri Romanowsky ei fersiwn ei hun ym mis Medi 1891. Daeth ei ganlyniadau gorau o botel esgeulusedig, wedi llwydo, o hydoddiant glas methylen a oedd dros ddau fis oed. Roedd disgrifiad Malachowski yn fwriadol ac, yn ei eiriau ef, yn hawdd ei atgynhyrchu; roedd un Romanowsky yn ben draw a weithiodd unwaith. Serch hynny, Romanowsky a gafodd yr eponym, ac mae'r anghydfod ynghylch pwy gynhyrchodd y porffor a wnaeth y cnewyllyn yn weladwy yn stori ar wahân gyda'i dogfennau ei hun.

Ffigur: yr ail siart tymheredd o adroddiad Guttmann ac Ehrlich ym 1891. Mae'r panel uchaf yn cwmpasu 13 i 24 Gorffennaf a'r panel isaf 25 Gorffennaf i 5 Awst; mae'r cofnodion ar yr ymyl yn enwi'r dosau a roddwyd, ac mae'r tymheredd yn aros yn agos at normal am dair wythnos olaf y cofnod. Atgynhyrchwyd o'r adroddiad fel y'i sganiwyd ar gyfer Krafts, Hempelmann a Skórska-Stania, Parasitology Research* 111:1–6 (2012), PMID 22411634.

Trodd aeddfedu allan i fod yn ddadfethyleiddio

Nid oedd neb a oedd yn ymwneud â'r gwaith yn y 1890au yn gwybod beth roedd "aeddfedu" yn ei wneud i las methylen. Daeth yr ateb o gemeg ddiwydiannol. Roedd Heinrich August Bernthsen wedi syntheseiddio'r prif gyfansoddyn phenothiazine ym 1883, wedi sefydlu ym 1885 fod glas methylen yn perthyn i'r teulu hwnnw, ac wedi dangos yn yr un cyfnod fod amodau alcalïaidd yn tynnu grwpiau methyl o'r lliw, gan gynhyrchu'r cyfansoddion a elwir bellach yn azures.

Echdynnodd Bernard Nocht y ffracsiwn gweithredol ym 1898 a 1899 ac ni allai ond ei alw'n Rot aus Methylenblau, coch o las methylen. Nododd Michaelis mai azure I ydoedd ym 1901. Cyflwynodd Jenner fethanol absoliwt fel toddydd ar gyfer gwaddod y lliw ym 1899, gan ddileu'r angen i osod ffilmiau gwaed â gwres; cyfunodd Leishman a Reuter y ddau ddatblygiad; cyhoeddodd Wright ddull symlach ym 1902. Cyfraniad Giemsa, hefyd ym 1902, oedd rhoi'r gorau i ddibynnu ar hydoddiant a oedd wedi aeddfedu ar hap a defnyddio meintiau mesuredig o liwiau hysbys yn lle hynny. Yna gwrthododd gyhoeddi sut roedd yn gwneud methylene azure pur a gwerthodd y dull i labordy Dr. Grübler, a farchnataodd y cynnyrch fel azure I ac a honnodd mai ei fersiwn ef yn unig oedd staen Giemsa dilys.

Cwblhaodd dau ryfel byd y gwaith ar ddamwain. Pan nad oedd modd cael lliwiau Almaenig, gweithiodd Lillie, Roe a Wilcox ar yr amnewidion Americanaidd a chanfod bod y staenio gorau'n dod o dair cydran ar wahân: glas methylen pur, ei gynnyrch dadelfennu azure B, ac eosin. Mae'r tri hynny'n parhau i fod yn brif gydrannau'r staen a ddefnyddir i ddiagnosio malaria heddiw, o dan enw sydd bellach yn cyfuno Malachowski, Wright a Giemsa.

Ffigur: ffurfiau cylch Plasmodium falciparum* mewn celloedd coch dynol, wedi'u staenio â dull math Romanowsky. Y strwythur porffor y tu mewn i'r cylch yw'r cromatin a wnaeth glas methylen Malachowski wedi'i drin â boracs yn weladwy am y tro cyntaf. Delwedd gan Ernst Hempelmann, wedi'i rhyddhau i'r parth cyhoeddus.

Un enw, sawl deunydd

Gadawodd y blynyddoedd a wahanodd y cydrannau hynny broblem a barhaodd yn hirach na'r cemeg. Tynnodd Ralph Lillie y llinell ym 1969 rhwng staeniau biolegol, "a weithgynhyrchir yn unol â manylebau caeth sy'n gymesur â'u defnyddiau cain a manwl", a staeniau anfiolegol ar gyfer lliwio tecstilau, sy'n "gofyn am safonau gweithgynhyrchu llai caeth a llai heriol". Roedd y ddau fath o gynnyrch yn dwyn yr un enw, ac nid gwahaniaeth mewn gradd oedd y gwahaniaeth rhyngddynt erioed. Nid yw manyleb a ysgrifennwyd ar gyfer cotwm a manyleb a ysgrifennwyd ar gyfer adweithydd diagnostig yn gyfnewidiol, ac nid oedd deunydd a wnaed yn unol â'r fanyleb decstilau wedi'i fwriadu i'w lyncu.

Azure B yw'r enghraifft gliriaf. Dyma ffurf monodadfethyleiddiedig glas methylen, mae ganddo weithgarwch ffarmacolegol mesuradwy ei hun, ac roedd yn bresennol fel cydran heb ei rheoli mewn paratoadau clinigol o las methylen am fwy na chanrif cyn i unrhyw un wahanu'r ddau. Canfu un grŵp fod meinwe ddynol a samplwyd mewn awtopsi ar ôl rhoi glas methylen yn cynnwys 5 i 14 y cant o las methylen heb newid a 86 i 95 y cant azure B. Mae p'un a ddylai paratoad penodol gynnwys azure B, ac ar ba derfyn, yn gwestiwn manyleb, ac mae'r ymchwil ar azure B fel amhuredd a metabolyn yn parhau oddi yno.

Yn y fanyleb hefyd y mae'r canlyniad ymarferol. Cydymffurfiaeth USP yw'r llwybr at y purdeb uchaf y mae'r farchnad yn ei gynnig, oherwydd ei fod yn safon brofi gyflawn a gyhoeddwyd yn hytrach nag yn un mesuriad. Mae'n cwmpasu hunaniaeth, assay, amhureddau organig gan gynnwys y lliwiau azure, toddyddion gweddilliol, amhureddau elfennol, gweddillion wrth danio, terfynau microbaidd, ac endotocsinau bacteriol. Mae tystysgrif sy'n adrodd canlyniad metel trwm ac yn ei alw'n gydymffurfiaeth USP wedi adrodd un llinell o'r rhestr honno.

Mae Blupreme yn cael ei las methylen gan weithgynhyrchydd fferyllol ac yn cyhoeddi'r dystysgrif ddadansoddi lawn, gan brofi'r fanyleb USP gyfan yn hytrach na metelau trwm yn unig. Mae'r canllaw i ddarllen tystysgrif ddadansoddi a beth mae'r dynodiad USP yn ei sefydlu a'r hyn nad yw'n ei sefydlu yn esbonio sut i wirio'r ddogfen yn erbyn yr honiad.

Yr hyn y mae'r hanes yn ei ganiatáu, a'r hyn nad yw'n ei ganiatáu

Mae'r llinach yn real, ac mae'n hirach nag y mae'r rhan fwyaf o dudalennau cynnyrch yn awgrymu. Defnyddiwyd glas methylen i drin malaria ym 1891, adroddwyd amdano fel tawelydd mewn seicosis gynhyrfus ym 1899, ac mae ei gadwyn ochr yn rhedeg drwy quinacrine, chloroquine, promethazine a chlorpromazine. Disgrifiodd papur Ehrlich ym 1890 gydag Arthur Leppmann leddfu poen niwralgaidd a gwynegol, ac yna ystyriodd ddefnyddio'r lliw mewn salwch meddwl ond penderfynodd beidio â'i brofi.

Nid yw dim o hynny'n sefydlu defnydd modern. Roedd canlyniad malaria 1891 yn seiliedig ar ddau glaf a siart tymheredd. Mae cynefindra hir â moleciwl yn rheswm i'w astudio, nid yn ganlyniad. Mae'r hanes o'r cyfansoddyn fel cyffur a'r treialon modern mewn malaria yn ateb cwestiynau gwahanol i'r rhai roedd Ehrlich yn eu gofyn, ac mae'n rhaid darllen y pwyntiau terfyn ar eu telerau eu hunain.

Mae un manylyn yn y cofnod sy'n perthyn i'r presennol yn hytrach na'r gorffennol. Pan gynhaliodd ymchwilwyr dreialon malaria glas methylen yn Burkina Faso yn y 2000au, cawsant eu hunain yn cystadlu am ddeunydd gradd fferyllol, ac adroddwyd bod pris y deunydd crai wedi codi tua chan gwaith ar ôl iddo gael dilysiad GMP. Gellid amnewid lliw. Ni ellid amnewid cyffur. Yr un gwahaniaeth a dynnodd Lillie ym 1969 yw'r un sy'n penderfynu beth sydd mewn potel heddiw.