Identifikace methylenové modři v laboratoři: infračervená spektra a doplňkové metody

Představte si, že tři laboratoře dostanou stejný modrý prášek. První zaznamená infračervené spektrum a prohlásí, že jde o methylenovou modř. Druhá provede chromatografii a uvede 0.4% Azure B. Třetí změří rentgenovou difrakci na krystalech a určí hydrátovou formu. Všechny tři mají pravdu a žádná z nich neodpověděla na zbývající dvě otázky. Zmatek začíná, když se jeden výsledek vykládá jako odpověď na všechny tři.

Tento článek tyto otázky odděluje. Infračervená identifikace potvrzuje molekulární identitu porovnáním s referenčním standardem. Chromatografie stanovuje složení. Difrakce určuje formu v pevném stavu. Vyhovující shoda při identifikaci není certifikátem čistoty.

Infračervená identifikace dobře odpovídá na jednu otázku

Lékopisná zkouška totožnosti methylenové modři spočívá v porovnání spektra se standardem, nikoli v odškrtávání seznamu píků. V náhledu monografie USP pro methylenovou modř uvádí zkouška totožnosti A infračervenou spektroskopii s optikou ATR nebo s tabletou bromidu draselného. Spektrum vzorku musí odpovídat spektru referenčního standardu USP, přičemž vzorek i standard musí být připraveny a změřeny za rovnocenných podmínek. O výsledku nerozhoduje žádný pevný seznam diagnostických vlnočtů. Rozhoduje překryv spekter.

Tato volba odpovídá tomu, jak se FTIR spektra methylenové modři chovají. Nejvýraznější pásy leží v oblasti otisku prstu. Přiřazení uváděná v literatuře shodně umisťují hlavní pás konjugovaného kruhového systému přibližně do oblasti 1590 až 1600 cm-1, kde se sdružují valenční vibrace aromatických vazeb uhlík–uhlík a uhlík–dusík. Další pásy kolem 1490 a 1390 cm-1 zahrnují deformace kruhu a vazeb uhlík–dusík a uhlík–vodík. Pásy kolem 1355 a 1330 cm-1 souvisejí s vazbami uhlík–dusík v dimethylaminových skupinách a s deformacemi methylových skupin. Pásy kolem 1225 až 1250 cm-1 patří heterocyklickému skeletu, zatímco pásy kolem 1170 až 1130 a 1066 cm-1 mají charakter vibrací vazeb uhlík–síra; deformační vibrace aromatických vazeb C-H se objevují kolem 880 cm-1. Valenční vibrace se nacházejí výše: aromatické C-H kolem 3040 cm-1 a N-methylové C-H přibližně mezi 2900 a 3000 cm-1. Publikovaná přiřazení se v detailech liší, protože fenothiaziniový skelet vibruje jako sdružený systém. Každou jednotlivou tabulku přiřazení proto berte jako popis uvedený konkrétním zdrojem, nikoli jako jediný možný výklad.

Pozornost si zaslouží dva vlivy přípravy, protože mění IR spektra methylenové modři, aniž by měnily samotné barvivo. Za prvé, hydratovaný materiál vykazuje široký pás O-H kolem 3300 až 3500 cm-1 a deformační vibrace vody kolem 1630 až 1640 cm-1; různé hydrátové formy navíc měřitelně posouvají pásy v oblasti otisku prstu. Za druhé, matrice tablety KBr je hygroskopická: absorbovaná vlhkost vytváří pásy právě v těchto oblastech vody a může být zaměněna za hydrátovou vodu ze vzorku. Měření pomocí ATR se matrici KBr vyhýbá, intenzity v ATR však závisejí na hloubce průniku, která se mění s vlnočtem. ATR spektrum a transmisní spektrum téhož prášku proto nelze přímo překrýt. Z lékopisného požadavku plyne praktické pravidlo: porovnávejte vzorek a referenční standard změřené stejnou technikou a zdokumentujte, která technika byla použita. Chemické souvislosti kationtu, soli a hydrátů, které stojí za těmito spektry, najdete v přehledu struktury a vlastností methylenové modři.

Tabulka pro výběr analytické metody

Tato tabulka slouží k výběru metody. V jednotlivých řádcích zjistíte, na kterou otázku metoda odpovídá, co potvrzuje vyhovující výsledek a co zůstává neprokázané.

Proč shoda infračervených spekter není certifikátem čistoty

Shoda při identifikaci vylučuje záměnu za jiné barvivo. Neurčuje však všechny složky vzorku. Největší význam mají tři omezení.

Za prvé, blízce příbuzné látky vypadají v infračervené oblasti podobně. Azure B se od methylenové modři liší jedinou methylovou skupinou, a jeho spektrum se proto spektru methylenové modři velmi podobá. Směs obsahující několik procent Azure B se stále dobře překrývá s referenčním spektrem methylenové modři. Detekce této nečistoty je úkolem chromatografie, který popisuje průvodce nečistotami methylenové modři a zkušebními metodami.

Za druhé, infračervená spektroskopie je metoda měřící vzorek jako celek a má omezenou citlivost k minoritním složkám. Malá množství příbuzných barviv, zbytkových rozpouštědel nebo anorganických zbytků se skryjí pod hlavními pásy. Nepřítomnost dalších píků je jen slabým důkazem nepřítomnosti nečistot.

Za třetí, celé porovnání se řídí referenčním standardem. Degradovaný standard, standard se spektrálními posuny v důsledku hydratace nebo standard, s nímž se nesprávně zacházelo, mění měřítko hodnocení. Totéž platí při kombinaci různých technik, například když se ATR spektrum vzorku hodnotí oproti referenci měřené v KBr. U každého závěru zaznamenejte šarži standardu, techniku a přípravu.

Směsi vyžadují ještě poslední upozornění. Spektrum, které se převážně shoduje, ale vykazuje raménka nebo anomálie intenzity, nelze označit za vyhovující s poznámkami pod čarou. Je to signál, že před identifikací je nutné oddělit složky vzorku.

Doplňkové metody v praxi

HPLC methylenové modři poskytuje odpověď na otázku složení, kterou infračervená spektroskopie poskytnout nemůže. Současná lékopisná metoda používá kolonu fenylového typu s gradientem vody a acetonitrilu obsahujícím kyselinu trifluoroctovou a detekuje při 246 nm, nikoli ve viditelné oblasti. Totožnost se určuje podle shody retenčního času s referenčním standardem; stejné porovnání slouží ke stanovení obsahu. Zkouška organických nečistot přiřazuje Azure B pomocí jeho vlastního referenčního materiálu při relativní retenci kolem 0.8 vůči methylenové modři při 1.0 a vyžaduje vysoké rozlišení mezi oběma píky. Všimněte si volby vlnové délky: absorpce v demethylační řadě se postupně posouvá směrem k červené oblasti, od thioninu kolem 600 nm přes Azure C, Azure A a Azure B až k methylenové modři kolem 670 nm. Detektor nastavený přibližně na 660 nm proto poskytuje napříč řadou nestejnou odezvu a podhodnocuje některé homology. Úplné profilování celé řady, je-li potřeba, vyžaduje metodu LC-MS/MS na koloně C18 s kvalifikovanými standardy pro každý analyt.

Prášková difrakce odpovídá na otázku formy v pevném stavu, jejíž podklady obě výše uvedené metody buď zničí, nebo přehlížejí: rozpuštění prášku pro chromatografii odstraní informace o krystalech a molekulární vibrace vypovídají o vazbách, nikoli o uspořádání na dlouhé vzdálenosti. Difrakční záznamy rozlišují hydrátové fáze a krystalinitu a methylenová modř takové zkoumání potřebuje více než většina materiálů. Rager a jeho kolegové při výzkumu pevného stavu identifikovali pět odlišných hydrátových struktur, včetně pentahydrátu, dvou dihydrátů, monohydrátu a hydrátu s mezilehlým stupněm hydratace, a mezi charakterizovanými formami nenašli žádný skutečný trihydrát. Zde záleží na laboratorním zacházení: vlhkost a teplota mění stabilitu hydrátů a intenzivní mletí může změnit fázi nebo snížit krystalinitu. Proto kontrolujte a dokumentujte relativní vlhkost a teplotu a omezte mletí na minimum. Označování hydrátů a jejich vliv na naváženou hmotnost podrobněji rozebírá článek hydrátové formy methylenové modři a jejich označování.

UV-Vis absorpce hraje podpůrnou roli. Známá maxima potvrzují očekávané chování roztoku a umožňují práci s koncentrací. Modrý roztok absorbující při očekávané vlnové délce však pouze odpovídá přítomnosti methylenové modři, aniž by ji dokazoval, protože příbuzná barviva absorbují v blízké oblasti.

Na co se ptát před nákupem

Převeďte tyto rozdíly do otázek při nákupu. Ptejte se, která šarže byla testována, jaká technika potvrdila totožnost, zda byl při zkoušce nečistot pomocí HPLC použit referenční materiál Azure B a zda byla hydrátová forma charakterizována, nebo pouze předpokládána. Především se ptejte, zda certifikát pokrývá celou specifikaci, nebo jen vybrané zkoušky. Mnoho prodejců, kteří deklarují lékopisnou shodu, testuje pouze těžké kovy, takže otázky totožnosti, obsahu, organických nečistot, rozpouštědel a mikrobiologických parametrů zůstávají nezodpovězené.

Blupreme ve spolupráci s farmaceutickým výrobcem methylenové modři testuje úplnou specifikaci USP, která zahrnuje totožnost, čistotu, organické nečistoty, zbytková rozpouštědla, elementární nečistoty, zbytek po žíhání, mikrobiologické limity a bakteriální endotoxiny. Veřejný certifikát analýzy každé šarže je zveřejněn na stránce testování kvality Blupreme, takže základ výpočtu obsahu a výsledky stanovení nečistot lze číst přímo, místo aby se odvozovaly. I u výsledků blízkých 100% musí být uveden základ výpočtu, jak vysvětluje průvodce stanovením obsahu nad 100 procent. Shoda při identifikaci zkoumání otevírá. Úplná dokumentace ho uzavírá.