Article
Pot el blau de metilè eludir el complex III mitocondrial? Per què els estudis discrepen
Dos laboratoris van preguntar si el blau de metilè pot eludir un complex III mitocondrial bloquejat. Un va respondre que no. L'altre va respondre que sí. Tots dos tenien dades.
El primer estudi, amb mitocondris de cervell de ratolí, va trobar que el colorant no ho pot fer. El segon, amb mitocondris cerebrals de tres espècies de rosegadors, va trobar que ho pot fer parcialment. Un tercer estudi, en fetge de ratolí, sovint se cita al costat d'aquests, però va posar a prova una altra cosa. Situar-lo on correspon aclareix la meitat de la confusió.
No hi ha cap mecanisme universal per anunciar. Hi ha tres experiments amb bloquejadors, dosis i mesures diferents. Cal llegir primer les condicions. Les conclusions en deriven.
Què vol dir aquí una via alternativa
Els electrons entren a la cadena a través del complex I (des del NADH) o del complex II (des del succinat), passen pel complex III fins al citocrom c i després pel complex IV fins a l'oxigen. El gradient que es genera al llarg del recorregut és el que la cèl·lula utilitza per produir ATP.
Afirmar que hi ha una via alternativa vol dir que el blau de metilè recull electrons abans d'un bloqueig i els lliura després. El colorant oxidat accepta electrons del NADH o de components inicials de la cadena i es converteix en blau de leucometilè; la forma reduïda els cedeix al citocrom c o els retorna a la cadena. Si la transferència es produeix després del bloqueig, la respiració i el potencial de membrana es recuperen parcialment. Si es produeix al punt del bloqueig o abans, no es recupera res.
Un detall del complex III determina bona part d'aquesta controvèrsia. El complex funciona mitjançant un cicle Q amb dos llocs d'unió d'inhibidors. L'antimicina s'uneix al lloc Qi. El mixotiazol s'uneix al lloc Qo. Un estudi que només en fa servir un ha posat a prova només la meitat del complex.
Primer estudi: cap via alternativa en mitocondris de cervell de ratolí
Gureev i col·laboradors van utilitzar mitocondris de l'escorça cerebral de ratolins C57BL/6, aïllats amb digitonina i assajats a 0.1 mg de proteïna per ml. Els substrats abastaven tres règims: piruvat més malat a 5 mM cadascun, succinat a 10 mM amb glutamat a 2 mM i L-prolina a 10 mM. Els bloquejadors eren rotenona a 1 micromolar (complex I) i antimicina a 1 microgram per ml (complex III). Les dosis de colorant eren de 0.5, 1 i 2 micromolar, amb 1 micromolar com a concentració principal. Els mètodes i els registres són a la comunicació de FEBS Letters.
La via alternativa al complex I va funcionar. La rotenona va reduir la respiració estimulada per ADP d'uns 121 a uns 2 nmol per minut per mg, i el colorant a 1 micromolar la va restablir fins a uns 21. El potencial de membrana es va recuperar amb piruvat més malat i amb L-prolina.
La via alternativa al complex III no va funcionar. L'antimicina va reduir la respiració fins a uns 16, i el colorant només la va elevar fins a uns 20. El potencial de membrana no es va recuperar amb cap substrat, amb dosis de colorant de fins a 5 micromolar. Les dades de peròxid apuntaven en la mateixa direcció: el colorant sol va augmentar l'emissió de peròxid des d'una taxa basal propera als 76 pmol per minut per mg fins a aproximadament 1170, 1460 i 1945 amb les tres dosis, però l'antimicina va reduir aquest senyal induït pel colorant en aproximadament un 25, un 88 i un 96 per cent, respectivament. Si el colorant reduït reaccionés directament amb l'oxigen, bloquejar el complex III no hauria de suprimir el senyal. Els autors van inferir que el colorant reduït s'oxida al lloc Qo del complex III, abans del bloqueig per antimicina. El circuit curt, en paraules: dels donadors al colorant, del colorant al Qo i, a partir d'aquí, per la ruta normal. S'eludeix la rotenona. L'antimicina, no.
Segon estudi: via alternativa parcial en tres espècies, als dos llocs d'unió d'inhibidors
Svab i col·laboradors van ampliar el disseny. Mitocondris cerebrals de ratolins, rates i conillets d'Índies, aïllats amb Percoll i assajats als mateixos 0.1 mg per ml, amb piruvat més malat o glutamat més malat a 5 mM cadascun. Van utilitzar dos bloquejadors del complex III: antimicina A a 0.3 micromolar i mixotiazol a 1 micromolar. El colorant era a 2 micromolar en la majoria dels assaigs i a 0.5 en els experiments amb citocrom c. Les tres espècies, amb protocols equivalents, es descriuen a l'article d'accés obert.
Es van eludir parcialment tots dos bloquejos en les tres espècies. En mitocondris de ratolí, l'antimicina va suprimir la respiració i el colorant la va augmentar aproximadament un 60 per cent, d'uns 37 a 59 nmol per minut per mg. El mixotiazol la va suprimir un 88 per cent, fins a uns 4.5, i el colorant la va multiplicar per cinc, fins a uns 23. El potencial de membrana es va repolaritzar parcialment amb qualsevol dels dos inhibidors; es va mesurar amb dos colorants (safranina O i TMRM ratiomètric) per descartar artefactes òptics.
Aquest article també va posar a prova directament la transferència, cosa que el primer estudi no va fer mai. Els mitocondris energitzats, amb inhibidors o sense, no reduïen el citocrom c acetilat exogen a 25 micromolar, però afegir-hi colorant va impulsar la reducció en tots dos casos. En una solució tampó sense cèl·lules, el NADH més el colorant van reduir el citocrom c a una velocitat proporcional al NADH. El salt més llarg, en paraules: dels equivalents reductors al colorant, del colorant directament al citocrom c i del complex IV a l'oxigen. Aquesta ruta evita completament el complex III, de manera que es poden eludir tots dos bloquejadors.
Dues mesures addicionals donen suport a aquesta interpretació. La fluorescència del NAD(P)H va disminuir quan es va afegir colorant als mitocondris tractats amb mixotiazol, cosa que indica que els equivalents reductors es consumien a través de la nova ruta. A més, l'absorbància del colorant a 660 nm va reflectir cada addició successiva, mentre que els sobrenedants obtinguts per centrifugació mostraven que el colorant oxidat es concentrava més de cent vegades a l'interior dels mitocondris energitzats i després en sortia quan el potencial col·lapsava. El balanç de protons també hi encaixa: evitar els passos de bombament deixa aproximadament 2 protons per parell d'electrons en lloc de 10; per tant, un consum d'oxigen més ràpid amb només una repolarització parcial és el que cal esperar d'una via alternativa real, no una prova en contra.
La mateixa preparació va produir respostes que no admeten una lectura superficial. Amb inhibidor més colorant, l'ADP va reduir la respiració en lloc d'augmentar-la, i el bloqueig del transport la va estimular en lloc de frenar-la, mentre que el potencial de membrana continuava canviant en les direccions normals. En aquest sistema, el consum d'oxigen per si sol indueix a error.
Tercer estudi: l'estudi hepàtic que va posar a prova els complexos I i II, no el III
Lee i Boelsterli van utilitzar mitocondris de fetge de ratolí i hepatòcits en cultiu danyats per efavirenz (complex I, IC50 propera a 30 micromolar) i hidrazina, el metabòlit de la isoniazida (complex II, IC50 propera a 30 micromolar). El colorant a uns 30 micromolar va restablir l'oxidació del NADH, el potencial de membrana i l'ATP, alhora que reduïa els oxidants i la mort necròtica. L'article de Redox Biology ho representa amb un model en què el colorant transporta electrons per evitar els complexos I i II danyats.
Aquest resultat és un context establert per als passos anteriors de la cadena i no diu res sobre el complex III, perquè no s'hi va bloquejar res. No pot confirmar ni refutar cap dels dos estudis cerebrals.
La matriu de condicions
| Condició | Gureev 2019 | Svab 2021 | Lee 2014 |
|---|---|---|---|
| Espècie i teixit | Escorça cerebral de ratolí | Cervell de ratolí, rata i conillet d'Índies | Fetge de ratolí, mitocondris i cèl·lules |
| Dosi de colorant | De 0.5 a 2 micromolar, principal 1 | 2 micromolar, 0.5 en assaigs de cyt c | Uns 30 micromolar |
| Bloquejador del complex III | Antimicina 1 ug per ml, només Qi | Antimicina 0.3 uM més mixotiazol 1 uM, Qi i Qo | Cap |
| Substrats | PM, succinat glutamat, prolina | PM o GM | Vinculats al NADH, dany als complexos I i II |
| Variables principals | Respiració, potencial, peròxid | Respiració, potencial amb dos colorants, NAD(P)H, estat redox del colorant, reducció de cyt c | Energètica, potencial, ATP, oxidants, mort |
| Resultat | Via alternativa al complex I sí, al III no | Via alternativa parcial amb qualsevol dels dos bloquejadors del III | Via alternativa que evita el dany als complexos I i II |
Quatre motius pels quals tots dos estudis del complex III poden tenir raó en les seves pròpies condicions
1. El bloquejador no representava la mateixa intervenció. Antimicina sola a 1 microgram per ml enfront d'antimicina a 0.3 micromolar més un bloquejador separat del lloc Qo. Una ruta del colorant que introdueix electrons al lloc Qo falla precisament allà on una ruta directa al citocrom c funciona. Un sol lloc no pot representar tots dos.
2. La dosi de colorant i els temps eren diferents. Concentracions principals d'1 enfront de 2 micromolar, en un compost amb cicle redox la captació del qual i la reducció directa del citocrom c depenen de la concentració i del temps. Petites diferències de dosi, combinades amb moments de mesura diferents, poden revelar trams diferents d'una mateixa xarxa.
3. Les preparacions eren diferents. L'aïllament amb digitonina i l'aïllament amb gradient de Percoll seleccionen poblacions mitocondrials que se superposen, però no són idèntiques. La concentració de proteïna coincidia a 0.1 mg per ml, de manera que aquesta variable queda descartada, però no la subpoblació ni la integritat. I es va descartar l'espècie com a possible explicació: el segon grup també va reproduir el seu fenotip en ratolí.
4. Les condicions dels substrats determinen què pot fer el colorant. Tres règims de substrats enfront de parells vinculats al NADH. El subministrament de NADH i el potencial de membrana determinen conjuntament a quina velocitat es redueix el colorant i com es distribueix, i una ruta que necessita colorant reduït al costat de citocrom c oxidat depèn d'aquesta elecció.
Com llegir la pròxima afirmació sobre una via alternativa
Cal preguntar quin complex es va bloquejar, amb quin inhibidor, en quin lloc i a quina dosi. Cal preguntar la concentració del colorant i quan es va fer la mesura. Cal preguntar pel teixit, l'espècie, l'aïllament, la concentració de proteïna i el substrat. I cal preguntar si el potencial, la respiració, l'estat redox i un assaig directe de transferència concorden, perquè aquí el consum d'oxigen per si sol va apuntar en la direcció equivocada més d'una vegada.
El resum delimitat es manté. Hi ha acord sobre la via alternativa del colorant al complex I. Pel que fa al complex III, els mitocondris de ratolí amb antimicina a 1 microgram per ml i colorant a 1 micromolar no mostren cap via alternativa funcional, mentre que tres espècies amb antimicina a 0.3 micromolar o mixotiazol a 1 micromolar i colorant a 2 micromolar mostren una via alternativa parcial amb transferència directa del colorant al citocrom c. Aquestes afirmacions poden coexistir. Qualsevol afirmació més àmplia és una extrapolació.
Les lectures relacionades situen l'afirmació controvertida dins d'una química no controvertida: com el blau de metilè transporta electrons per entendre la transferència, els experiments de la via alternativa al complex I per al cas establert dels passos anteriors de la cadena, les mesures del potencial de membrana i els seus artefactes per entendre per què calien dos colorants, i la manipulació al laboratori de compostos amb cicle redox per a les dificultats relacionades amb les dosis i els temps.