Alternatives al blau de metilè per a microscòpia: trieu segons la tasca

Per a un frotis bacterià senzill, el violeta de cristall pot substituir el blau de metilè quan l'objectiu és observar la forma de les cèl·lules. Per a cèl·lules vives, una alternativa millor pot ser el contrast de fase sense cap tinció. L'elecció depèn de l'observació que necessiteu fer.

Suposem que dues persones examinen el mateix cultiu bacterià. Una vol distingir els bacils de les cèl·lules rodones. L'altra vol saber si un tractament ha matat els bacteris. Una tinció que ofereix a la primera persona una imatge clara pot no proporcionar cap resposta útil a la segona.

Abans de triar un substitut, completeu aquesta frase: “Necessito observar ___ en ___, i les cèl·lules han / no han de romandre vives.” Aquesta frase defineix la funció que ha de complir la tinció.

Comenceu per la mostra i la pregunta

Primer decidiu si les cèl·lules han de romandre vives i, després, identifiqueu la característica que necessiteu observar:

• Les cèl·lules han de romandre vives: per al moviment o la forma, considereu el contrast de fase o DIC sense tinció; per a l'ADN nuclear, considereu Hoechst 33342 amb fluorescència; per a la integritat de la membrana, trieu un assaig validat com SYTO 9 amb iodur de propidi.
• Les cèl·lules no han de romandre vives: per a la morfologia bacteriana, considereu una tinció simple amb violeta de cristall o una tinció negativa amb nigrosina; per a la reacció de Gram, utilitzeu el mètode complet de tinció de Gram; per a l'ADN nuclear en cèl·lules fixades, considereu la fluorescència amb DAPI.

Utilitzeu aquesta taula per comparar les limitacions de cada opció. Són eleccions de mètode, no instruccions per intercanviar reactius dins d'un protocol existent.

Per a un frotis senzill, substituïu el mètode amb cura

El violeta de cristall és una opció pràctica quan la tasca consisteix a obtenir una vista monocromàtica de la morfologia bacteriana. El Bacteriological Analytical Manual de l'FDA enumera dues formulacions de violeta de cristall adequades per a la tinció simple. Utilitzeu una formulació documentada i el seu mètode de preparació; el nom del colorant, per si sol, no especifica un reactiu de treball.

El violeta de cristall també s'utilitza en la tinció de Gram, però això no converteix una tinció simple amb violeta de cristall en una tinció de Gram. En el protocol de tinció de Gram de l'ASM, el resultat diferencial depèn de l'acció seqüencial del violeta de cristall, el iode, la decoloració i la contratinció. Ometre aquests passos canvia allò que la imatge permet determinar. Consulteu tinció simple versus tinció de Gram per veure aquesta distinció.

La nigrosina ofereix una manera diferent de revelar els contorns: enfosqueix el fons mentre les cèl·lules bacterianes romanen comparativament clares. Hi ha un detall útil a les instruccions de Merck per a la nigrosina que una llista genèrica de substituts pot passar per alt. La formulació de treball especificada inclou formaldehid. Per tant, no podeu inferir la compatibilitat amb cèl·lules vives a partir de l'expressió “tinció negativa”, encara que les mateixes cèl·lules semblin no tenyides. Comproveu la formulació completa i la preparació de la mostra.

Per a mostres vives, considereu canviar l'òptica

Si voleu observar com es mouen o es divideixen les cèl·lules, introduir un altre colorant pot complicar l'observació. Tal com explica Nikon a la seva guia sobre el contrast en mostres transparents, el contrast de fase i el contrast d'interferència diferencial, o DIC, fan visibles les mostres mitjançant diferències en les seves propietats òptiques. Poden revelar cèl·lules vives sense tenyir, sempre que el microscopi disposi dels components necessaris.

Aquesta elecció manté una preparació sense tinció, però modifica la informació disponible. Podeu seguir un contorn o un moviment sense saber quina molècula ha produït el contrast. Si la pregunta és la localització molecular, seleccioneu un mètode de marcatge adequat.

Per a l'ADN nuclear, la comparació de tincions DAPI i Hoechst d'Invitrogen distingeix l'ús habitual de DAPI amb cèl·lules fixades del Hoechst 33342, més permeable a les cèl·lules i preferit per al marcatge de cèl·lules vives. Tots dos requereixen equipament de fluorescència. Cap dels dos és un substitut directe d'una tinció acolorida de camp clar.

Considereu l'exposició al colorant i la il·luminació com a condicions experimentals. Compareu preparacions tenyides i no tenyides quan el comportament de les cèl·lules sigui la variable que mesureu.

Una cèl·lula vermella no és automàticament una cèl·lula morta

SYTO 9 i iodur de propidi s'utilitzen sovint conjuntament per avaluar la integritat de la membrana bacteriana. El manual de BacLight associa les membranes intactes amb una tinció verda i les membranes danyades amb una tinció vermella. Aquesta interpretació s'ha de validar per a la mostra concreta.

Un estudi de 2019 de Rosenberg i col·laboradors il·lustra el problema. En biofilms d'E. coli de 24 hores sobre vidre en solució salina tamponada amb fosfat, aproximadament el 96% de les cèl·lules apareixien positives per a iodur de propidi in situ. Tanmateix, els autors van estimar que el 82% eren cultivables després de la recol·lecció. Les imatges confocals mostraven cèl·lules amb interiors verds sota material tenyit de vermell, fet que apuntava als àcids nucleics extracel·lulars com a causa del senyal enganyós.

Aquests percentatges descriuen mesures diferents en les preparacions de l'estudi, no un factor de correcció universal. La lliçó útil és comprovar què ha generat el senyal. En un biofilm, un colorant d'àcids nucleics pot detectar material fora de les cèl·lules, així com dins de cèl·lules danyades. Per arribar a una conclusió sobre la viabilitat, els investigadors recomanen mesures complementàries, com ara el cultiu o l'activitat metabòlica, tot reconeixent que cadascuna té limitacions.

Comproveu què conté realment l'alternativa

Un mètode de tinció alternatiu encara pot contenir blau de metilè. Giemsa n'és un exemple: Merck descriu el seu producte com una solució d'azure-eosina-blau de metilè, destinada a aplicacions que inclouen frotis de sang i de medul·la òssia. Pot ser un mètode diferent per a una mostra diferent, però no compleix un requisit d'excloure el blau de metilè.

Si excloure un compost forma part de l'experiment, comproveu la identitat i la formulació del reactiu abans de comparar les imatges. La guia sobre blau de metil, blau de metilè i colorants amb noms semblants tracta les diferències de nomenclatura.

Verifiqueu la substitució abans d'utilitzar-ne el resultat

Per a un mètode nou, feu una petita comparació amb mostres representatives i un control adequat. Mantingueu comparables els ajustos del microscopi sempre que sigui possible. Registreu la formulació del reactiu, la preparació de la mostra, l'exposició i les condicions d'imatge perquè una imatge aparentment millor es pugui investigar en lloc de limitar-se a ser preferida.

Avalueu l'èxit segons la pregunta original. Per a la morfologia, avalueu si els límits cel·lulars i la disposició continuen sent interpretables. Per al marcatge nuclear, avalueu la localització del senyal i el fons. Per a la viabilitat, exigiu evidència més enllà d'una separació de colors atractiva. La guia més àmplia sobre tinció amb blau de metilè i aplicacions de laboratori explica com encaixen l'observació i la preparació.

Trieu l'alternativa que preservi la mesura que necessiteu. El color és només una de les propietats de la imatge resultant.