Per què l'absorció del blau de metilè canvia amb la concentració

Agafeu una ampolla de solució mare de blau de metilè i ompliu dos vasos. Ompliu el primer amb la solució mare i el segon amb una dilució de deu vegades. El segon vas és més pàl·lid, com era d'esperar. Mireu-los de prop i veureu que també ha canviat una altra cosa. La tonalitat ha variat. Una solució tendeix a un blau cel clar i l'altra a un blau amb un matís violaci. La dilució ha fet més que reduir la intensitat. Ha canviat quina espècie química és responsable de la major part de l'absorció.

El concepte que explica aquest canvi és senzill. El blau de metilè dissolt no és una única espècie. Un catió individual del colorant, anomenat monòmer, es pot apilar cara a cara amb un segon catió per formar un dímer, i els dímers poden donar lloc a agregats més grans. Cada forma té el seu propi espectre d'absorció. El que registra un espectrofotòmetre és la suma de les contribucions de la mescla present en aquella cubeta, en aquelles condicions. Si canvieu la mescla, l'espectre varia, fins i tot quan el contingut total de colorant segueix una proporció de dilució simple.

El monòmer i el dímer absorbeixen de manera diferent

Imagineu el monòmer com una carta plana amb una càrrega positiva distribuïda pel seu sistema d'anells. Dues cartes d'aquest tipus es poden disposar cara a cara. Les càrregues positives es repel·leixen, però les superfícies aromàtiques planes s'atreuen mitjançant interaccions d'apilament, i l'aigua i els contraions que les envolten apantallen la repulsió. El resultat és una parella unida amb estats electrònics compartits. Les seves transicions permeses tenen una energia més alta que la transició del monòmer, de manera que la banda del dímer apareix a una longitud d'ona més curta que la del monòmer, mentre que els agregats més grans contribueixen encara més cap al costat blau en forma d'espatlla.

A concentracions molt baixes en aigua neta, predominen els monòmers i domina la banda de longitud d'ona llarga. A mesura que augmenta la concentració total, la forma aparellada representa una proporció creixent i la banda de longitud d'ona més curta augmenta respecte de la primera. Per tant, la relació entre les dues bandes indica la composició de la mescla, no directament la concentració total. Una lectura a una única longitud d'ona no pot separar les dues contribucions sense un supòsit sobre quina forma hi és present.

Per això, els espectres de referència sempre han d'anar acompanyats de les condicions. La referència espectral del blau de metilè recull en taules les posicions de les bandes juntament amb el dissolvent, el medi salí, el pH, la temperatura i l'interval de concentracions en què s'han obtingut. Si citeu un pic sense aquestes condicions, el valor queda insuficientment especificat. Dos laboratoris poden tenir raó sobre espectres diferents del mateix colorant perquè han mesurat mescles diferents.

Què desplaça l'equilibri

La concentració és el factor principal. La formació d'un dímer requereix que dos monòmers es trobin, de manera que la seva proporció augmenta més ràpidament que de manera lineal amb el colorant total. Les constants de dimerització en medi aquós publicades són de l'ordre de milers per molar prop de la temperatura ambient, de manera que la proporció de dímers augmenta pronunciadament dins de l'interval micromolar. Un ajust global ampli que abastava concentracions de colorant de micromolars a mil·limolars va trobar una contribució no nul·la dels tetràmers ja per sota de 34 micromolar, cosa que adverteix del risc de confiar en un ajust estrictament de dues espècies a desenes de micromolar. Les fraccions exactes depenen del medi; per això, aquest article indica tendències en lloc d'oferir una taula de conversió universal.

La sal és el segon factor. Els ions dissolts apantallen la repulsió entre dos cations, de manera que l'addició de clorur de sodi i d'electròlits similars desplaça la mescla cap als dímers i els agregats amb la mateixa concentració de colorant. Aquest efecte és visible en els estudis sobre l'agregació del blau de metilè en medis salins i aquosos, en què es van mesurar concentracions de colorant d'aproximadament 1 micromolar a 3.4 mil·limolar amb concentracions de clorur de sodi de 0 a 0.15 molar. En aquell ajust, la fracció de tetràmers va arribar a aproximadament 0.93 a l'extrem amb concentracions elevades tant de colorant com de sal. Per tant, un espectre registrat en aigua i un de registrat en solució salina fisiològica no són patrons intercanviables.

La temperatura actua en sentit contrari. L'apilament allibera aigua lligada i el moviment tèrmic s'hi oposa, de manera que escalfar una solució acostuma a dissociar alguns dímers en monòmers, mentre que refredar-la afavoreix l'associació. L'entalpia de dissociació obtinguda de l'ajust és negativa, d'aproximadament menys 30 quilojoules per mol entre 282 i 333 kelvin, cosa que confirma una associació exotèrmica. Una mostra freda mesurada immediatament després de la refrigeració pot semblar més agregada que la mateixa mostra mesurada després d'equilibrar-se a temperatura ambient.

El dissolvent estableix el punt de partida. L'aigua, amb el seu fort efecte hidrofòbic, afavoreix l'apilament dels cations plans del colorant. Els alcohols com l'etanol i el metanol solvaten millor els anells i desfan els agregats, de manera que, a la mateixa concentració de colorant, l'espectre és més propi del monòmer en etanol que en aigua. Els cosolvents apròtics fan el mateix: en mescles d'aigua i DMSO a 293 kelvin, l'addició de DMSO va suprimir la dimerització, cosa que apunta a l'estructura de l'aigua com a factor impulsor de l'apilament. Els tensioactius requereixen precaució en tots dos sentits. Per sobre de la seva concentració micel·lar crítica, les micel·les poden solubilitzar els monòmers individualment i restablir un espectre semblant al del monòmer. Per sota d'aquest punt, un tensioactiu amb càrrega oposada pot afavorir l'apilament: a 100 micromolar de colorant, la polimerització induïda per SDS va assolir el màxim prop de 4 mil·limolar de SDS, aproximadament la meitat de la concentració de formació de micel·les, abans de redistribuir-se a concentracions més altes de tensioactiu. Els treballs sobre els efectes del dissolvent i dels medis organitzats en els espectres del blau de metilè il·lustren fins a quin punt l'entorn molecular immediat, i no només la concentració global, determina les bandes observades.

El pH és important sobretot als extrems. Dins de l'interval proper a la neutralitat utilitzat en la major part del treball de laboratori, el blau de metilè es manté en la seva forma blava catiònica habitual, i l'agregació domina el comportament espectral. Els àcids o les bases forts, la química redox que produeix la forma leuco incolora o la unió a proteïnes i partícules afegeixen estats més enllà de la parella monòmer-dímer. Quan un espectre canvia després d'afegir-hi un tampó, comproveu si la composició del tampó inclou sals i components que s'hi puguin unir abans d'atribuir-ho tot únicament al pH. La referència sobre química i protonació manté aquestes qüestions d'identitat separades de la qüestió de l'agregació tractada aquí.

Per què es corba la recta de Beer-Lambert

La relació de Beer-Lambert diu que l'absorbància és igual a l'absortivitat multiplicada per la concentració i per la longitud del camí òptic. És una llei de recompte. Pressuposa que els objectes comptats es mantenen idèntics quan en canvia el nombre: una única espècie absorbent, un espectre fix, cap canvi químic amb la concentració, llum de mesura monocromàtica, absència de dispersió o reemissió i llum que realment recorre el camí indicat.

L'agregació trenca el primer supòsit. Formalment, l'absorbància total continua sent una suma de les contribucions de les espècies: la longitud del camí òptic multiplicada per l'absortivitat de cadascuna i per la seva pròpia concentració. Cada espècie compleix la llei. La mescla no, perquè les concentracions de les espècies són funcions no lineals del colorant total. Per tant, una corba de calibratge de l'absorbància a la banda del monòmer en funció del colorant total comença sent recta al límit de dilució i es corba cap avall a mesura que augmenta la concentració, perquè cada increment afegit aporta proporcionalment menys monòmer. Una corba obtinguda a la banda del dímer es corba en sentit contrari. Els treballs sobre agregació identifiquen precisament aquest mecanisme com l'origen de les desviacions de Lambert-Beer observades. Ajustar una recta a la regió corbada i extrapolar-la és l'error habitual. La recta només és vàlida dins de l'interval i la matriu en què es va construir.

La dilució crea una trampa relacionada. Diluir una solució mare concentrada per entrar dins de l'interval de l'instrument no preserva la proporció entre espècies. A la cubeta diluïda, l'equilibri es restableix cap al monòmer, de manera que el seu espectre descriu correctament la mostra diluïda però no la solució mare. Calcular retrospectivament l'espectre de la solució mare multiplicant les absorbàncies només permet recuperar l'estimació del contingut total si el calibratge ja té en compte el desplaçament. No recupera mai la forma original de les bandes. Qui compara l'espectre d'un concentrat amb una referència diluïda està comparant dues mescles diferents.

La longitud del camí òptic forma part del resultat

L'absorbància varia proporcionalment amb la distància que recorre la llum a través de la mostra. Una cubeta de 10 mm dona una absorbància deu vegades superior a la d'una cubeta d'1 mm que contingui la mateixa solució. Aquesta proporcionalitat només és exacta per a la mateixa solució, i l'agregació fa que aquesta condició sigui essencial.

A la pràctica, la longitud del camí òptic és una eina per mantenir-se dins de l'interval vàlid. Un camí llarg proporciona sensibilitat per a solucions diluïdes, majoritàriament monomèriques. Un camí curt manté una mostra concentrada dins de l'escala sense una gran dilució que restabliria l'equilibri. El programa d'estudi de l'agregació del qual provenen les xifres anteriors va aplicar precisament això: cel·les d'1 centímetre per a concentracions de colorant d'1.1 a 34 micromolar, i cel·les de 0.01 centímetres per a concentracions de 94 micromolar a 3.4 mil·limolar. Els pedestals de microvolum i els lectors de plaques hi afegeixen una geometria pròpia, amb camins curts i de vegades variables, a més de superfícies on el colorant catiònic es pot adsorbir. Indiqueu el camí òptic juntament amb el valor, de la mateixa manera que la referència espectral indica el dissolvent i la sal. Una absorbància sense una longitud del camí òptic no és un resultat. És un rumor.

El rigor en la mesura es deriva del mecanisme. Equilibreu les mostres a una mateixa temperatura abans de fer la lectura. Utilitzeu el mateix tipus i orientació de cubeta, blancs concordants que continguin el mateix medi salí i el mateix tampó, i material de vidre net, perquè el blau de metilè s'adsorbeix al vidre i al plàstic, i una cubeta tenyida conserva el record de l'última mostra concentrada. Feu la lectura poc després de la preparació quan la cinètica d'agregació sigui rellevant, i construïu cada corba de calibratge en la mateixa matriu i amb la mateixa longitud del camí òptic que les mostres de concentració desconeguda. Per a les comprovacions visuals, recordeu que l'ull és un espectròmetre deficient. Si el color de la solució pot establir-ne la puresa és una qüestió diferent amb una resposta negativa, i els canvis de tonalitat causats per l'agregació en són un dels motius.

Un diagrama per tenir al costat de l'instrument

La figura següent resumeix l'article en una referència per al banc de laboratori. Tres solucions comparteixen el mateix colorant, però difereixen en la concentració total i en el medi salí. Els seus espectres esquemàtics mostren com la banda del monòmer de longitud d'ona llarga perd pes respecte de la banda del dímer de longitud d'ona més curta a mesura que augmenta l'apilament. Les condicions estan indicades a la figura perquè, sense elles, les corbes no es poden reutilitzar. Per consultar posicions de bandes mesurades en condicions especificades, utilitzeu la referència espectral. Per saber com entra el colorant a les cèl·lules un cop és en solució, vegeu l'entrada a les cèl·lules mitjançant reducció i repartiment. Per saber com la dosi de llum i la geometria condicionen encara més les lectures fotoquímiques, vegeu l'exposició a la llum i la geometria de mesura.

La regla que cal retenir té dues parts. L'espectre identifica la mescla present a la cubeta en les condicions indicades. Només un calibratge construït en aquestes mateixes condicions converteix una absorbància en una concentració total.