Identifikacija metilenskog plavila u laboratoriji: infracrveni spektri i komplementarne metode

Zamislite da tri laboratorije dobiju isti plavi prah. Prva snimi infracrveni spektar i proglasi ga metilenskim plavilom. Druga provede hromatografsku analizu i prijavi 0.4% Azure B. Treća analizira difrakciju rendgenskih zraka na kristalima i odredi hidratni oblik. Sve tri su u pravu, a nijedna nije odgovorila na druga dva pitanja. Zabuna nastaje kada se jedan rezultat tumači kao odgovor na sva tri.

Ovaj članak razdvaja ta pitanja. Infracrvena identifikacija utvrđuje molekulski identitet poređenjem s referentnim standardom. Hromatografija utvrđuje sastav. Difrakcija utvrđuje oblik u čvrstom stanju. Podudaranje koje zadovoljava kriterij identifikacije nije potvrda čistoće.

Infracrvena identifikacija dobro odgovara na jedno pitanje

Farmakopejsko ispitivanje identiteta metilenskog plavila zasniva se na poređenju spektra sa standardom, a ne na kontrolnoj listi pikova. U pregledu USP monografije za metilensko plavilo, ispitivanje Identifikacija A navodi infracrvenu spektroskopiju uz ATR optiku ili pelet kalijevog bromida. Spektar uzorka mora odgovarati spektru USP referentnog standarda, pri čemu se uzorak i standard pripremaju i snimaju pod jednakovrijednim uslovima. Odluka se ne zasniva na unaprijed utvrđenoj listi dijagnostičkih valnih brojeva. Zasniva se na preklapanju spektara.

Takav pristup odražava ponašanje FTIR spektara metilenskog plavila. Najizraženije karakteristike nalaze se u području otiska prsta. Dodjele vibracijskih traka u literaturi dosljedno smještaju glavnu traku konjugiranog prstena blizu 1590 do 1600 cm-1, gdje se sprežu vibracije istezanja aromatskih veza ugljik-ugljik i ugljik-azot. Druge trake blizu 1490 i 1390 cm-1 imaju karakter deformacijskih vibracija prstena te veza ugljik-azot i ugljik-vodik. Trake blizu 1355 i 1330 cm-1 uključuju veze ugljik-azot dimetilamino grupa i deformacije metilnih grupa. Karakteristike blizu 1225 do 1250 cm-1 pripadaju heterocikličnom skeletu, dok trake blizu 1170 do 1130 i 1066 cm-1 imaju karakter vibracija veza ugljik-sumpor, uz savijanje aromatskih veza C-H blizu 880 cm-1. Vibracije istezanja pojavljuju se pri višim valnim brojevima: aromatske veze C-H blizu 3040 cm-1 i veze C-H N-metilnih grupa između približno 2900 i 3000 cm-1. Objavljene dodjele razlikuju se u pojedinostima jer fenotiazinski kationski skelet vibrira kao spregnuti sistem, pa svaku pojedinačnu tabelu dodjela treba posmatrati kao prijavljeno tumačenje, a ne kao jedino moguće.

Dva efekta pripreme zaslužuju pažnju jer mijenjaju IR spektre metilenskog plavila bez promjene samog bojila. Prvo, hidratizirani materijal pokazuje široku O-H traku oko 3300 do 3500 cm-1 te savijanje molekula vode blizu 1630 do 1640 cm-1, a različiti hidratni oblici mjerljivo pomjeraju trake u području otiska prsta. Drugo, matrica KBr peleta je higroskopna: apsorbirana vlaga stvara trake upravo u tim područjima vode i može se pogrešno protumačiti kao hidratna voda iz uzorka. ATR snimanje izbjegava KBr matricu, ali intenziteti ATR traka zavise od dubine prodiranja koja se mijenja s valnim brojem, pa se ATR spektar i transmisijski spektar istog praha ne mogu direktno preklopiti. Praktično pravilo proizlazi iz farmakopejskog zahtjeva: poredite uzorak i referentni standard snimljene istom tehnikom i dokumentirajte koja je tehnika korištena. Za hemijske osnove kationa, soli i hidrata koji stoje iza ovih spektara pogledajte referentni pregled strukture i svojstava metilenskog plavila.

Tabela za izbor analitičke metode

Ova tabela služi kao alat za izbor metode. Čitajte svaki red da biste utvrdili na koje pitanje metoda odgovara, šta potvrđuje rezultat koji zadovoljava kriterije i šta ostaje nedokazano.

Zašto podudaranje infracrvenih spektara nije potvrda čistoće

Podudaranje pri identifikaciji isključuje pogrešno bojilo. Ne daje popis sastojaka uzorka. Tri ograničenja su najvažnija.

Prvo, blisko srodni spojevi imaju slične infracrvene spektre. Azure B razlikuje se od metilenskog plavila po jednoj metilnoj grupi, pa njegov spektar veoma liči na spektar metilenskog plavila. Smjesa koja sadrži nekoliko posto Azure B i dalje se dobro preklapa s referentnim spektrom metilenskog plavila. Otkrivanje te nečistoće zadatak je hromatografije, opisane u vodiču za nečistoće metilenskog plavila i metode ispitivanja.

Drugo, infracrvena spektroskopija je tehnika koja analizira uzorak kao cjelinu i ima ograničenu osjetljivost na komponente prisutne u malim količinama. Male količine srodnih bojila, rezidualnih rastvarača ili anorganskih ostataka skrivene su ispod glavnih traka. Odsustvo dodatnih pikova slab je dokaz odsustva nečistoća.

Treće, referentni standard određuje cijelo poređenje. Razgrađen standard, standard sa spektralnim pomacima zbog hidratacije ili standard kojim se nepravilno rukovalo mijenja osnovu procjene. Isto čini i poređenje neusklađenih tehnika, poput ocjenjivanja ATR spektra uzorka prema KBr referentnom spektru. Uz svaku ocjenu zabilježite seriju standarda, tehniku i način pripreme.

Smjese zahtijevaju još jednu napomenu. Spektar koji se uglavnom podudara, ali ima ramena ili anomalije intenziteta, nije zadovoljavajući rezultat uz fusnote. To je znak da komponente uzorka treba razdvojiti prije identifikacije.

Komplementarne metode u praksi

HPLC analiza metilenskog plavila daje odgovor o sastavu koji infracrvena spektroskopija ne može dati. Trenutna farmakopejska metoda koristi kolonu fenilnog tipa s gradijentom vode i acetonitrila koji sadrži trifluoroctenu kiselinu, uz detekciju na 246 nm, a ne u vidljivom području. Identitet se utvrđuje podudaranjem retencijskog vremena s referentnim standardom; isto poređenje služi i za određivanje sadržaja. Ispitivanje organskih nečistoća identificira Azure B pomoću njegovog zasebnog referentnog materijala pri relativnoj retenciji blizu 0.8 u odnosu na metilensko plavilo na 1.0 i zahtijeva visoku rezoluciju između ta dva pika. Obratite pažnju na izbor valne dužine: niz demetiliranih bojila apsorbira sve dalje prema crvenom dijelu spektra, od tionina blizu 600 nm, preko Azure C, Azure A i Azure B, do metilenskog plavila blizu 670 nm. Detektor podešen blizu 660 nm zato daje nejednak odziv za različite članove niza i potcjenjuje količine nekih homologa. Potpuno profiliranje cijelog niza, kada je potrebno, zahtijeva LC-MS/MS metodu s C18 kolonom i kvalificiranim standardima za svaki analit.

Difrakcija praha odgovara na pitanje o čvrstom stanju čije informacije obje prethodne metode uništavaju ili zanemaruju: rastvaranje praha za hromatografiju briše informacije o kristalima, a molekulske vibracije daju informacije o vezama, a ne o uređenju na velikim udaljenostima. Difrakcijski obrasci razlikuju hidratne faze i kristaliničnost, a metilensko plavilo zahtijeva takvu provjeru više nego većina materijala. Istraživanja čvrstog stanja koja su proveli Rager i kolege identificirala su pet različitih hidratnih struktura, uključujući pentahidrat, dva dihidrata, monohidrat i intermedijarni hidrat, te među okarakteriziranim oblicima nisu pronašla pravi trihidrat. Laboratorijsko rukovanje ovdje je važno: vlažnost i temperatura mijenjaju stabilnost hidrata, a intenzivno mljevenje može promijeniti fazu ili smanjiti kristaliničnost. Zato kontrolirajte i dokumentirajte relativnu vlažnost i temperaturu te mljevenje svedite na minimum. Označavanje hidrata i njegov utjecaj na odvaganu masu detaljnije su obrađeni u članku o hidratnim oblicima metilenskog plavila i njihovom označavanju.

UV-Vis apsorpcija ima dopunsku ulogu. Poznati maksimumi potvrđuju očekivano ponašanje rastvora i omogućavaju određivanje koncentracije, ali plavi rastvor koji apsorbira na očekivanoj valnoj dužini samo je u skladu s metilenskim plavilom, bez dokaza njegovog identiteta, jer srodna bojila apsorbiraju na bliskim valnim dužinama.

Šta pitati prije kupovine

Pretvorite ove razlike u pitanja pri kupovini. Pitajte koja je serija ispitana, kojom je tehnikom utvrđen identitet, je li pri HPLC ispitivanju nečistoća korišten referentni materijal Azure B i je li hidratni oblik okarakteriziran ili pretpostavljen. Prije svega, pitajte obuhvata li certifikat cijelu specifikaciju ili samo odabrana ispitivanja. Mnogi prodavači koji tvrde da je proizvod usklađen s farmakopejskim zahtjevima ispituju samo teške metale, pa pitanja identiteta, sadržaja, organskih nečistoća, rastvarača i mikrobiološke kvalitete ostaju bez odgovora.

Blupreme provodi ispitivanja prema cjelokupnoj USP specifikaciji, koja obuhvataju identitet, čistoću, organske nečistoće, rezidualne rastvarače, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granične vrijednosti i bakterijske endotoksine, u saradnji s farmaceutskim proizvođačem metilenskog plavila. Javni certifikat analize za svaku seriju objavljuje se na stranici Blupreme ispitivanje kvalitete, pa se osnova određivanja sadržaja i rezultati za nečistoće mogu pročitati direktno umjesto da se o njima zaključuje posredno. Čak i uz rezultate blizu 100% treba navesti osnovu njihovog izračuna, kako objašnjava vodič za rezultate određivanja sadržaja iznad 100 posto. Podudaranje pri identifikaciji započinje provjeru. Cjelokupna dokumentacija je završava.