Идентифициране на метиленово синьо в лабораторията: инфрачервени спектри и допълващи методи

Представете си, че три лаборатории получават един и същ син прах. Първата регистрира инфрачервен спектър и го определя като метиленово синьо. Втората извършва хроматографски анализ и отчита 0.4% Azure B. Третата изследва дифракцията на рентгенови лъчи от кристалите и определя хидратна форма. И трите са прави, но нито една не е отговорила на другите два въпроса. Объркването започва, когато един резултат се възприема като отговор и на трите.

Тази статия разграничава тези въпроси. Инфрачервената идентификация установява молекулната идентичност чрез сравнение с референтен стандарт. Хроматографията установява състава. Дифракцията установява формата в твърдо състояние. Успешното съвпадение при изпитване за идентичност не е сертификат за чистота.

Инфрачервената идентификация отговаря добре на един въпрос

Фармакопейното изпитване за идентичност на метиленово синьо представлява сравнение на спектър със стандарт, а не контролен списък от пикове. В предварителния преглед на монографията на USP за метиленово синьо изпитването „Идентификация A“ посочва инфрачервена спектроскопия с ATR оптика или таблетка от калиев бромид. Спектърът на пробата трябва да съответства на спектъра на референтния стандарт на USP, като пробата и стандартът се подготвят и спектрите им се регистрират при еквивалентни условия. Решението не се основава на фиксиран списък от диагностични вълнови числа, а на наслагването на спектрите.

Този подход отразява поведението на FTIR спектрите на метиленовото синьо. Най-силните сигнали се намират в областта на спектралния отпечатък. Отнасянията в литературата последователно поставят основната ивица на спрегнатите пръстени около 1590 до 1600 cm-1, където валентните трептения на ароматните връзки въглерод–въглерод и въглерод–азот са свързани. Допълнителните ивици около 1490 и 1390 cm-1 имат характер на пръстенни трептения и деформационни трептения, включващи въглерод–азот и въглерод–водород. Ивиците около 1355 и 1330 cm-1 включват връзките въглерод–азот в диметиламиногрупите и деформационните трептения на метиловите групи. Сигналите около 1225 до 1250 cm-1 принадлежат на хетероцикличния скелет, а ивиците около 1170 до 1130 и 1066 cm-1 имат характер на трептения на въглерод–сяра, с деформационни трептения на ароматни C-H около 880 cm-1. Валентните трептения се появяват при по-високи вълнови числа: ароматни C-H около 3040 cm-1 и N-метилови C-H приблизително между 2900 и 3000 cm-1. Публикуваните отнасяния се различават в подробностите, защото фенотиазиниевият скелет трепти като свързана система, затова разглеждайте всяка отделна таблица с отнасяния като публикувана интерпретация, а не като единствено възможната.

Два ефекта от подготовката заслужават внимание, защото променят инфрачервените спектри на метиленовото синьо, без да променят багрилото. Първо, хидратираният материал показва широка O-H ивица около 3300 до 3500 cm-1 и деформационни трептения на водата около 1630 до 1640 cm-1, а различните хидратни форми изместват измеримо ивиците в областта на спектралния отпечатък. Второ, матрицата на таблетката от KBr е хигроскопична: погълнатата влага създава ивици точно в тези области за водата и може да бъде погрешно възприета като хидратна вода от пробата. Измерването чрез ATR избягва матрицата от KBr, но интензитетите при ATR зависят от дълбочината на проникване, която се изменя с вълновото число, така че ATR спектър и трансмисионен спектър на един и същ прах не могат да се наслагват директно. Практическото правило следва от фармакопейното изискване: сравнявайте проба и референтен стандарт, измерени с една и съща техника, и документирайте коя е използвана. За химията на катиона, солта и хидратите, която стои зад тези спектри, вижте справочния материал за структурата и свойствата на метиленовото синьо.

Таблица за избор на аналитичен метод

Тази таблица служи като инструмент за избор. Прочетете всеки ред, за да разберете на кой въпрос отговаря даден метод, какво установява положителният резултат и какво остава недоказано.

Защо инфрачервеното съвпадение не е сертификат за чистота

Съвпадението при изпитване за идентичност изключва погрешно багрило. То не описва пълния състав на пробата. Най-важни са три ограничения.

Първо, близкородствените вещества си приличат в инфрачервената област. Azure B се различава от метиленовото синьо само с една метилова група, затова спектърът му много наподобява този на метиленовото синьо. Смес, съдържаща няколко процента Azure B, все пак се наслагва добре върху референтния спектър на метиленово синьо. Откриването на този примес е задача на хроматографията, разгледана в ръководството за примесите в метиленовото синьо и методите за изпитване.

Второ, инфрачервената спектроскопия е техника за изследване на пробата като цяло с ограничена чувствителност към минорните компоненти. Малки количества сродни багрила, остатъчни разтворители или неорганични остатъци се скриват под основните ивици. Липсата на допълнителни пикове е слабо доказателство за липса на примеси.

Трето, референтният стандарт определя цялото сравнение. Стандарт, който е разграден, чийто спектър е изместен поради хидратация или с който е работено неправилно, променя основата за оценка. Същото важи и при несъответстващи техники, например когато ATR спектър на проба се оценява спрямо референтен спектър, получен с KBr. Записвайте партидата на стандарта, техниката и подготовката заедно с всяко заключение.

Смесите налагат още една предпазна мярка. Спектър, който съвпада в по-голямата си част, но има рамена или аномалии в интензитета, не е положителен резултат с бележки под линия. Той е сигнал, че компонентите на пробата трябва да бъдат разделени преди идентификацията.

Допълващи методи на практика

HPLC анализът на метиленово синьо дава отговора за състава, който инфрачервената спектроскопия не може да предостави. Настоящият фармакопеен метод използва колона от фенилен тип с градиент вода–ацетонитрил, съдържащ трифлуороцетна киселина, и детекция при 246 nm, а не във видимата област. Идентичността се установява чрез съответствие на времето на задържане с референтния стандарт; същото сравнение служи и за количественото определяне. Изпитването за органични примеси идентифицира Azure B чрез собствен референтен материал при относително задържане около 0.8 спрямо метиленовото синьо при 1.0 и изисква висока разделителна способност между двата пика. Обърнете внимание на избора на дължина на вълната: серията от продукти на деметилиране абсорбира постепенно все по-близо до червената област — от тионин около 600 nm през Azure C, Azure A и Azure B до метиленово синьо около 670 nm. Затова детектор, настроен близо до 660 nm, дава нееднакъв отклик за веществата в серията и подценява някои хомолози. Пълното профилиране на цялата серия, когато е необходимо, изисква C18 LC-MS/MS метод с квалифицирани стандарти за всеки аналит.

Праховата дифракция отговаря на въпроса за твърдото състояние, чиято информация двата метода по-горе унищожават или пренебрегват: разтварянето на праха за хроматография заличава информацията за кристалите, а молекулните трептения дават сведения за връзките, а не за подреждането на далечни разстояния. Дифракционните картини разграничават хидратните фази и кристалността, а метиленовото синьо се нуждае от такова внимателно изследване повече от повечето материали. Изследванията на твърдото състояние от Rager и колеги идентифицират пет различни хидратни структури, включително пентахидрат, два дихидрата, монохидрат и междинен хидрат, и не откриват истински трихидрат сред характеризираните форми. Работата с материала в лабораторията е важна: влажността и температурата променят стабилността на хидратите, а интензивното смилане може да промени фазата или да намали кристалността, затова контролирайте и документирайте относителната влажност и температурата и сведете смилането до минимум. Обозначаването на хидратите и влиянието му върху претеглената маса са разгледани по-подробно в хидратни форми и означаване на метиленовото синьо.

UV-Vis абсорбцията има подпомагаща роля. Познатите максимуми потвърждават очакваното поведение на разтвора и позволяват работа по определяне на концентрацията, но син разтвор, който абсорбира при очакваната дължина на вълната, е съвместим с наличието на метиленово синьо, без да го доказва, тъй като сродните багрила абсорбират в близки области.

Какво да попитате преди покупка

Превърнете тези разграничения във въпроси при покупка. Попитайте коя партида е изпитана, коя техника е установила идентичността, дали при HPLC изпитването за примеси е използван референтният материал за Azure B и дали хидратната форма е характеризирана, или само е приета по предположение. Преди всичко попитайте дали сертификатът обхваща цялата спецификация, или само избрани изпитвания. Много продавачи, които заявяват съответствие с фармакопеята, изпитват само за тежки метали, което оставя без отговор въпросите за идентичността, количественото съдържание, органичните примеси, разтворителите и микробиологичните показатели.

Blupreme извършва изпитвания по пълната спецификация на USP, обхващащи идентичност, чистота, органични примеси, остатъчни разтворители, елементни примеси, остатък след накаляване, микробиологични граници и бактериални ендотоксини, в партньорство с фармацевтичен производител на метиленово синьо. Публичният сертификат за анализ за всяка партида се публикува на страницата изпитвания за качество на Blupreme, така че основата за количественото определяне и резултатите за примесите могат да бъдат прочетени директно, вместо да се извеждат по предположение. Дори при резултати близо до 100% трябва да бъде посочена основата за изчислението, както обяснява ръководството за количествено съдържание над 100 процента. Съвпадението при идентификацията поставя началото на проверката. Пълната документация я завършва.