Як працуе метыленавы сіні? Акісляльна-аднаўленчая хімія і механізмы

Колба з коркам на лабараторным стале — самы кароткі і сумленны спосаб растлумачыць, як працуе метыленавы сіні. Вада, глюкоза, дробка гідраксіду натрыю і дастаткова фарбавальніка, каб вадкасць стала насычанага, беспамылкова пазнавальнага сіняга колеру. Пачакайце некалькі хвілін — і сіні колер знікне, пакуль колба не стане выглядаць як звычайная колба з вадой. Страсіце яе — і колер імгненна вернецца. Потым ён зноў знікне, і гэта будзе паўтарацца да таго часу, пакуль ёсць глюкоза, гатовая аддаваць электроны, і кісларод, гатовы іх прымаць.

У фарбавальніку не змянілася нічога, акрамя колькасці электронаў, якія ён нясе. У акісленай форме ён сіні. У адноўленай — не. Амаль усё астатняе ў тэрапеўтычнай і даследчай літаратуры пра гэтую малекулу вынікае з гэтага аднаго зваротнага кроку, бо малекула, здольная забіраць электроны ў аднаго партнёра і перадаваць іх іншаму, з'яўляецца пасярэднікам, а пасярэднік сам па сабе нічога не робіць. Яго дзеянне цалкам залежыць ад таго, што знаходзіцца на кожным канцы гэтага ланцуга.

Дзве формы і чаму гэтая пара мае значэнне

Акісленая форма ўяўляе сабой плоскую станоўча зараджаную кальцавую сістэму. Менавіта гэтая плоская зараджаная форма тлумачыць, чаму яна ўкладваецца ўздоўж нуклеінавых кіслот, звязваецца з сіяліраванымі структурамі на клетачных мембранах і моцна паглынае бачнае святло прыкладна паміж 600 і 700 нанаметрамі — у той частцы спектра, якую чалавечае вока ўспрымае як сінюю.

Адноўленая форма — зусім іншая. Яна не мае зараду, раствараецца ў тлушчы, а не ў вадзе, і бясколерная. Пры pH унутры арганізма ступень яе іанізацыі вельмі нізкая — усяго некалькі працэнтаў. Таму адноўленая малекула лёгка праходзіць праз клетачную мембрану шляхам дыфузіі, а апынуўшыся ўнутры, дзе асяроддзе больш акісляльнае, можа зноў акісліцца і фактычна апынуцца ў пастцы. Акісленая кальцавая сістэма плоская; адноўленая можа скручвацца. Гэтыя структурныя наступствы, як і сама змена колеру, з'яўляюцца асобнай часткай гісторыі дзвюх формаў і падрабязней разглядаюцца ў параўнанні метыленавага сіняга і лейкаметыленавага сіняга.

Прыём электронаў

Акіслены фарбавальнік здольны прымаць электроны ад шырокага спектра донараў. Глюкоза ў дэманстрацыйнай колбе — адзін з іх. Унутры клеткі іншымі з'яўляюцца адноўленыя пірыдынавыя нуклеатыды і кампаненты мітахандрыяльнага ланцуга пераносу электронаў. Калі метыленавы сіні аднаўляецца ў тканцы, якая змяшчае кісларод, запушчаны ім цыкл расходуе і аднаўляльнік, і кісларод, а таксама ўтварае актыўныя формы кіслароду, галоўным чынам перакіс вадароду. Фарбавальнік выходзіць з гэтага цыкла нязмененым і гатовым паўтарыць яго зноў.

Апошні момант тлумачыць супярэчнасць, якая інакш магла б выглядаць як нядбайнасць. У літаратуры метыленавы сіні апісваюць і як прааксідант, і як антыаксідант, і абодва апісанні маюць падставы. Ён можа зніжаць утварэнне супераксіду, дзейнічаючы як штучны акцэптар электронаў і адводзячы іх паток ад ферментных цэнтраў, дзе кісларод у іншым выпадку ператвараўся б у супераксідныя радыкалы. У культурах клетак печані было паказана, што ён індукуе ферменты антыаксідантнай абароны фазы 2, у тым ліку тыярэдаксінрэдуктазу 1 і NADPH-хінон-аксідарэдуктазу. Які з гэтых двух бакоў праявіцца, залежыць ад таго, на якім канцы ланцуга ў гэты момант не хапае электронаў. Пытанне накшталт «ці з'яўляецца метыленавы сіні антыаксідантам» сфармулявана некарэктна, пакуль не ўдакладнена, у якой сістэме, пры якой канцэнтрацыі і ў прысутнасці якіх іншых рэчываў.

Перадача электронаў далей

Калі фарбавальнік ужо ўтрымлівае лішні электрон, далей могуць адбыцца тры зусім розныя рэчы, якія звычайна апісваюць пад адным загалоўкам. Так рабіць не варта.

Ён можа перадаць электрон металічнаму цэнтру. Найбольш выразны прыклад — гемаглабін, у якім жалеза было акіслена з двухвалентнага да трохвалентнага стану. У такім стане ён не можа пераносіць кісларод. У эрытрацытах фермент аднаўляе фарбавальнік, пасля чаго адноўлены фарбавальнік неферментатыўна перадае электроны акісленаму жалезу гема, аднаўляючы функцыянальны гемаглабін і вяртаючы фарбавальнік у акісленую форму. Фарбавальнік пры гэтым не расходуецца; ён цыркулюе ў цыкле. Клінічная сітуацыя, заснаваная на гэтай рэакцыі, адносіцца да бальнічнай практыкі, а тлумачэнне прымянення метыленавага сіняга пры метгемаглабінеміі разглядае, як яго выкарыстоўваюць і чаму гэта патрабуе такога строгага нагляду.

Важная заўвага адносна крыніц: два агляды, на якіх заснаваны гэты артыкул, называюць розныя аднаўляльныя кафактары для ферментатыўнага этапу — адзін указвае NADH, а другі NADPH. Гэтае разыходжанне сапраўды прысутнічае і не вырашана ў даступных тут крыніцах, таму найбольш карэктна апісваць ролю кожнага кампанента, а не называць адзін канкрэтны кафактар.

Ён можа перадаць энергію або электрон кіслароду, калі ёсць святло. Гэты шлях існуе толькі пры асвятленні. Узбуджаны фарбавальнік пераходзіць у трыплетны стан, пасля чаго магчымыя два механізмы. У першым узбуджаны фарбавальнік непасрэдна ўзаемадзейнічае з суседняй малекулай, забіраючы вадарод або перадаючы электрон, у выніку чаго ўтвараюцца радыкалы; такое ўзаемадзеянне з вадой утварае гідраксільныя радыкалы. У другім энергія ўзбуджэння перадаецца непасрэдна кіслароду, утвараючы сінглетны кісларод — вельмі электрафільную форму, якая распадаецца за мікрасекунды і звычайна лічыцца асноўным шляхам, праз які асветлены метыленавы сіні пашкоджвае мікробныя клеткі. Сярод задакументаваных вынікаў — рэакцыі з ліпідамі і пептыдамі клетачнай абалонкі, а таксама з гуанінавымі асновамі ў DNA.

Практычнае наступства гэтага шляху заключаецца ў тым, што асвятленне змяняе колькасныя паказчыкі на парадкі. У даных, сабраных Wainwright і Crossley, мінімальная бактэрыцыдная канцэнтрацыя метыленавага сіняга супраць Pseudomonas aeruginosa складае каля 500 мікрамоляў у цемры і каля 25 мікрамоляў пры светлавой дозе 12 джоўляў на квадратны сантыметр. Для аднаго штаму Staphylococcus aureus значэнні ў цемры і пры асвятленні аднолькавыя — 5 мікрамоляў. Іншымі словамі, тое, ці можна наогул лічыць малекулу антымікробнай у дадзеных умовах, не з'яўляецца ўласцівасцю толькі самой малекулы; гэта ўласцівасць спалучэння малекулы са святлом.

Ён можа дзейнічаць непасрэдна на ферментны цэнтр, без удзелу пераноснага ланцуга. Метыленавы сіні акісляе двухвалентнае жалеза, звязанае з сінтазай аксіду азоту, што інактывуе фермент. Ён блакуе растваральную гуанілатцыклазу, і ад 1 да 10 мікрамоляў — стандартная лабараторная канцэнтрацыя, якая выкарыстоўваецца для гэтай мэты. Ён інгібіруе монаамінаксідазу тыпу A з IC50 ад 27 да 180 нанамоляў, што з'яўляецца механізмам добра задакументаванага ўзаемадзеяння з інгібітарамі зваротнага захопу сератаніну і прычынай, чаму лекавыя ўзаемадзеянні метыленавага сіняга разглядаюцца як асобная катэгорыя.

Гэтыя тры шляхі хімічна розныя. Звядзенне іх да аднаго сцвярджэння, што метыленавы сіні працуе праз акісляльна-аднаўленчае цыкліраванне, — галоўная прычына таго, чаму так шмат тэкстаў пра яго адначасова гучаць упэўнена і застаюцца расплывістымі.

Чатыры адрозненні, ад якіх залежыць, ці мае сцвярджэнне пра механізм сэнс

Якая форма. Адноўлены фарбавальнік не ўзаемазамяняльны з акісленым. Інгібіраванне ацэтылхалінестэразы добра паказвае гэтую пастку: пры працяглай інкубацыі in vitro метыленавы сіні паступова аднаўляецца да сваёй бясколернай формы, і інгібіраванне слабее, таму што адноўленая малекула не інгібіруе гэты фермент. Аналіз, які працягваецца дастаткова доўга, каб змянілася форма рэчыва, пакажа слабейшы эфект і можа прывесці да няправільнага тлумачэння.

Якая канцэнтрацыя. Лабараторны дыяпазон для інгібіравання растваральнай гуанілатцыклазы складае ад 1 да 10 мікрамоляў. Для поўнага спынення перадачы сігналу, апасродкаванай глутаматам, у зрэзах гіпакампа пацукоў патрабавалася ад 5 да 50 мікрамоляў. Таксічныя эфекты ў культурах клетак апісваюцца пры канцэнтрацыях вышэй за 100 мікрамоляў. Гэта не адзін і той жа эксперымент, і механізм, пацверджаны пры 50 мікрамолях, не абавязкова будзе дзейнічаць у пацыента, у якога плазменная канцэнтрацыя складае толькі частку гэтага значэння.

Які шлях увядзення. Абсалютная пероральная біодаступнасць складае каля 72 працэнтаў, а канчатковы перыяд паўвывядзення з плазмы — ад 5 да 7 гадзін. Пероральнае ўвядзенне стварае больш высокія канцэнтрацыі ў кішэчніку і печані; нутравеннае — больш высокія канцэнтрацыі ў галаўным мозгу. Шлях увядзення вызначае, якая тканка сустрэне гэтыя электроны.

Якая мадэль і ці было ўключана святло. Значная частка літаратуры пра механізмы заснавана на культурах клетак і даследаваннях на грызунах, а вынікі in vitro для гэтай малекулы залежаць ад уздзеяння святла, мембраннага патэнцыялу і акісляльна-аднаўленчага стану клетак, бо нават лямпы мікраскопа дастаткова для яе фотасенсібілізацыі. Ад 65 да 85 працэнтаў уведзенай дозы аднаўляецца да бясколернай формы ў эрытрацытах і перыферычных тканках. Кожная з гэтых зменных стаіць паміж чыстым механізмам у лабараторнай пасудзіне і сцвярджэннем пра чалавека.

Чаму пытанне чысціні — гэта пытанне хіміі

Асвятленне дэмэтылюе метыленавы сіні. Першым прадуктам з'яўляецца Azure B, затым Azure A, потым тыянін, а большая інтэнсіўнасць святла прыводзіць да мацнейшага распаду, чым меншая. Таму малекула, карыснасць якой заснавана на здольнасці прымаць і аддаваць электроны, мае верагодныя прадукты распаду, што з'яўляюцца блізкімі хімічнымі родзічамі і застаюцца ў тым жа растворы. Склад змесціва ёмістасці — не касметычная дробязь.

Менавіта таму адпаведнасць спецыфікацыі USP з'яўляецца значным крытэрыем для пакупніка. Прадукт, які ёй не адпавядае, — гэта фарбавальнік, а фарбавальнік можа ўтрымліваць прымесі, у тым ліку Azure B, цяжкія металы і рэшткавыя растваральнікі, якія чалавеку не патрэбныя пры праглынанні. Яшчэ адна пастка — прадавец, які правярае толькі цяжкія металы і прадстаўляе гэты вынік як поўную адпаведнасць патрабаванням. Blupreme супрацоўнічае з фармацэўтычным вытворцам метыленавага сіняга і правярае поўную спецыфікацыю: ідэнтычнасць, чысціню, арганічныя прымесі, рэшткавыя растваральнікі, элементныя прымесі, рэшту пасля пракальвання, мікрабіялагічныя межы і бактэрыяльныя эндатаксіны. Дакумент аб лабараторным тэсціраванні кожнай партыі публікуецца, а выбар пастаўшчыка у значнай ступені зводзіцца да праверкі таго, ці існуе такі дакумент і што менавіта ён ахоплівае.

Адна зваротная пара. Некалькі шляхоў, якія з яе выходзяць. Менавіта шлях вызначае, што можна сцвярджаць.