Эксперыменты, якія звязалі метыленавы сіні з клетачным дыханнем

Дэфібрынаваная кроў чалавека, вытрыманая пры 37 °C на працягу трох гадзін, спажывае каля двух працэнтаў кіслароду, які ў ёй змяшчаецца. Калі перад інкубацыяй дадаць невялікую колькасць метыленавага сіняга, тая самая кроў спажывае каля шасцідзесяці пяці працэнтаў. У саміх клетках нічога не змянілася. Змяніўся толькі раствор.

Гэтая лічба паходзіць з працы Джорджа Хэрапa і Э. С. Гусмана Бэрана, апублікаванай ва Універсітэце Джонса Хопкінса ў 1928 годзе. Менавіта з яе бярэ пачатак шырока паўтаральнае сцверджанне, што метыленавы сіні паляпшае клетачнае дыханне. Гэтае сцверджанне не памылковае, але яго сэнс вузейшы, чым здаецца.

Што насамрэч вымярае лічба ў табліцы

Вымяралі паглынанне кіслароду, якое вызначалі газавым аналізам. Хэрап і Бэран фільтравалі свежаўзятую кроў праз вату пры 10 °C, каб выдаліць лейкацыты, насычалі ўзор кіслародам, дзялілі яго на часткі, дадавалі фарбавальнік у адну з іх і аналізавалі абедзве пасля інкубацыі. Колькасць лейкацытаў рэдка перавышала прыкладна тысячу на кубічны міліметр. Спажыванне кіслароду падавалі як долю пачатковага ўтрымання кіслароду ва ўзоры, якая знікла.

Яны таксама вымяралі вуглякіслы газ, але тут метад ствараў цяжкасці. За першую гадзіну інкубацыі дэфібрынаваная кроў вылучала да двух мілімоляў вуглякіслага газу на 100 mL з прычын, не звязаных з даследаванай рэакцыяй, таму дыхальныя каэфіцыенты для суцэльнай крыві былі непрыдатныя. Толькі адмытыя клеткі ў растворы Лока давалі паказчыкі, якія можна было інтэрпрэтаваць, і яны знаходзіліся ў межах ад 0.73 да 0.80 як з фарбавальнікам, так і без яго.

Гэта не дробязь. У гэтых працах «дыханне» азначае газаабмен у закрытай пасудзіне. Розніца паміж спажываннем кіслароду і выхадам карыснай энергіі асобна разглядаецца ў артыкуле што спажыванне кіслароду кажа і чаго не кажа пра ATP.

Фарбавальнік дадаваў найбольш там, дзе клеткі дыхалі найменш

У спелых эрытрацытаў млекакормячых амаль няма вымернага спажывання кіслароду. У эрытрацытаў птушак, якія маюць ядро, яно ёсць. Хэрап і Бэран даследавалі абодва тыпы, і кантраст паміж імі стаў асновай іх аргументацыі.

Ва ўзорах млекакормячых фарбавальнік павялічваў спажыванне ў дваццаць–пяцьдзесят разоў. У гусінай крыві, клеткі якой ужо дыхалі, ён ніколі не павялічваў хуткасць больш чым удвая. Чым вышэйшым быў зыходны ўзровень дыхання, тым менш мог дадаць фарбавальнік.

Тая самая залежнасць назіралася і ў межах аднаго віду. Узор крыві пацыента з сапраўднай паліцытэміяй, які змяшчаў няспелыя клеткі, без фарбавальніка спажываў 11.3 працэнта свайго кіслароду супраць 2.8 працэнта ў адмытых клетак здаровага донара. Фарбавальнік павялічыў гэты паказчык толькі да 63.4 працэнта: паскарэнне ў шэсць разоў там, дзе нармальныя клеткі паскараліся амаль у трыццаць разоў. Фарбавальнік набліжаў паводзіны спелых клетак да паводзін няспелых — менавіта так аўтары і апісвалі яго дзеянне.

Цыянід павінен быў гэта спыніць

Было вядома, што цыянід спыняе клетачнае акісленне. Хэрап і Бэран усё ж дадалі яго разам з фарбавальнікам.

Вынікі для крыві буйной рагатай жывёлы паказальныя. Без якіх-небудзь дабавак утрыманне кіслароду за тры гадзіны знізілася з 22.61 да 22.03 аб’ёмных працэнта. З метыленавым сінім яно знізілася да 12.84. З метыленавым сінім і цыянідам калію ў канцэнтрацыі адна пяцітысячная моль на літр — да 12.74. Эфект фарбавальніка практычна не змяніўся.

Малюнак: бесперапынны мікрарэспіраметрычны запіс для эрытрацытаў чалавека. Стрэлка пазначае дадаванне метыленавага сіняга. Да гэтага крывая амаль гарызантальная; пасля яна няўхільна падымаецца. Узноўлена з працы Хэрапа і Бэрана, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Яны прыйшлі да высновы, што фарбавальнік дзейнічае як пераносчык кіслароду, «забяспечваючы рэчыва, якое знікла са спелых бяз’ядравых эрытрацытаў млекакормячых». Праз два гады Міхаэліс і Саламон з Інстытута Ракфелера надалі гэтай розніцы ў інтэрпрэтацыях яе ўстойлівую форму. Альбо эфект фарбавальніка быў «выпадковай уласцівасцю фарбавальніка», альбо фарбавальнік быў «мадэллю нейкага невядомага рэчыва ў арганізмах». Выбар паміж гэтымі тлумачэннямі так і не зроблены. Змянілася тое, што цяпер самі клеткі можна апісаць значна дакладней.

Экстракт печані рабіў тое самае

Міхаэліс і Саламон паказалі, што экстракты органаў, атрыманыя халоднай вадой, выклікаюць такую самую стымуляцыю. Наймацней дзейнічаў экстракт печані пацука, за ім ішлі нырка, селязёнка і яечка. Мозг, мышцы і сыроватка крыві амаль не ўплывалі або не ўплывалі зусім.

Затым яны праверылі дзеянне экстракту ў прысутнасці монааксіду вугляроду. Дыханне, выкліканае як экстрактам, так і фарбавальнікам, не змянялася ў сумесі з 98 працэнтаў монааксіду вугляроду і 2 працэнтаў кіслароду. Тая самая газавая сумесь прыгнятала дыханне дрожджаў і ядзерных эрытрацытаў курэй прыкладна на 60–80 працэнтаў, што адпавядала апісанню Варбургам дыхальнага ферменту, адчувальнага да монааксіду вугляроду. Такім чынам, неідэнтыфікаванае рэчыва з тканак не было ферментам Варбурга.

Па ходзе даследавання некалькі магчымых кандыдатаў былі адкінутыя. Адноўлены глутатыён і цыстэін выклікалі толькі тое спажыванне кіслароду, якое патрабавалася для іх уласнага акіслення. Кафермент Гардэна і Янга выключылі, бо ў мышцах яго найбольш, а эфект у іх быў амаль найменшы. Цытахром Кейліна, які атрымаў сваю назву некалькімі гадамі раней, сутыкнуўся з той самай супярэчнасцю. Уласную думку, што актыўнае рэчыва паходзіць з клетачнага ядра, яны назвалі толькі здагадкай.

Эфект залежаў ад пэўных умоў

Клеткі мусілі заставацца непашкоджанымі. Гемоліз, выкліканы дыстыляванай вадой або паўторным замарожваннем, ліквідаваў рэакцыю і на фарбавальнік, і на экстракт, а частковы гемоліз прапарцыйна яе змяншаў.

Патрэбны быў і цукар. Глюкоза, фруктоза і цукроза падтрымлівалі дыханне, выкліканае фарбавальнікам; манітол — не. Без цукру дыхання не было зусім, і, відаць, у гэтых умовах фарбавальнік пашкоджваў клеткі, таму глюкоза, дададзеная праз адну ці дзве гадзіны, не аднаўляла яго. Аўтары выказалі здагадку, што фарбавальнік акісляў неабходны клетцы структурны кампанент.

Асвятленне значна ўзмацняла эфект фарбавальніка, хаця ён быў відавочны і ў цемры. Іншыя фарбавальнікі, здольныя да аднаўлення, паводзілі сябе інакш: талуіленавы сіні дзейнічаў гэтак жа моцна, як метыленавы сіні, або мацней, а індыгадысульфанат амаль не дзейнічаў. Выразнай сувязі паміж акісляльна-аднаўленчым патэнцыялам фарбавальніка і велічынёй яго эфекту не выявілі; аўтары тлумачылі гэта пранікальнасцю мембран і таксічнасцю.

Эфект адпавядаў браджэнню, а не дыханню

У даследаванні 1930 года Бэран перайшоў ад клетачных суспензій да зрэзаў тканак нармальных органаў пацука і перасаджаных пухлін.

У тканках без аэробнага гліколізу метыленавы сіні не дзейнічаў або крыху прыгнятаў спажыванне кіслароду: у нырцы прыкладна на 14 працэнтаў, у падстраўнікавай залозе прыкладна на 14 працэнтаў, у печані прыкладна на 5 працэнтаў. У тканках, якія ажыццяўляюць браджэнне пры наяўнасці кіслароду, ён павялічваў спажыванне: у селязёнцы прыкладна на 8 працэнтаў, у мозгу прыкладна на 13 працэнтаў. Для пухлін павелічэнне складала ад прыкладна 27 працэнтаў у карцыноме малочнай залозы чалавека да больш як 80 працэнтаў у саркоме Раўса ў курыцы, прыблізна прапарцыйна аэробнаму гліколізу кожнай тканкі.

Малюнак: кожная кропка — адзін тып тканкі. Гарызантальная вось паказвае аэробны гліколіз, вертыкальная — змену спажывання кіслароду пасля дадавання метыленавага сіняга. Даныя з працы Бэрана, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), табліца 6, PMID 19869777.

Затым эксперымент з цыянідам даў люстральную карціну. Калі дыханне ў гэтых раней неадчувальных тканках блакавалі цыянідам і браджэнне выходзіла на першы план, фарбавальнік зноў павялічваў спажыванне кіслароду: у нырцы прыкладна на 59 працэнтаў, у печані прыкладна на 19 працэнтаў, у селязёнцы прыкладна на 286 працэнтаў, у яечку прыкладна на 200 працэнтаў.

Бэран прапанаваў выкарыстоўваць фарбавальнік як тэст на здольнасць клеткі або тканкі да браджэння і завяршыў працу здагадкай: шмат пакаленняў пухліннай культуры ў асяроддзі з фарбавальнікам, магчыма, калі-небудзь змогуць назаўсёды зрабіць метабалізм пухліны падобным да метабалізму нармальнай тканкі. Гэта было даследчае пытанне, сфармуляванае ў 1930 годзе. Гэта не сцверджанне пра лячэнне.

Чаго гэтыя эксперыменты не маглі вымяраць

У 1928 і 1930 гадах «дыханне» азначала спажыванне кіслароду. Пра адэназінтрыфасфат упершыню паведамілі ў 1929 годзе, а тое, што ізаляваныя мітахондрыі этэрыфікуюць фасфат пры пераносе электронаў, паказалі ў 1949 годзе. Ніводная з ранніх прац пра метыленавы сіні не магла вымяраць выпрацоўку энергіі, і ніводная на гэта не прэтэндавала.

Другая праблема — самі клеткі. Спелыя эрытрацыты млекакормячых не змяшчаюць мітахондрый. На стадыі рэтыкулацытаў яны пазбаўляюцца мітахондрый і рыбасом шляхам выбарачнай аўтафагіі. Таму спелы эрытрацыт атрымлівае энергію праз гліколіз і залежыць ад пентозафасфатнага шляху галоўным чынам дзеля NADPH, а не ATP. У эксперыментах 1928 года не было ланцуга пераносу электронаў, які можна было б аднавіць. Што б ні спажывала кісларод, яно рабіла нешта іншае.

Што менавіта гэта было, цяпер апісана даволі добра. Метыленавы сіні прымае электроны ад клетачных аднаўленчых эквівалентаў і ператвараецца ў лейкаметыленавы сіні, які зноў акісляецца малекулярным кіслародам, замыкаючы цыкл. У эрытрацытах чалавека этап аднаўлення ажыццяўляюць NADPH-залежная флавінрэдуктаза і роднасныя дысульфідрэдуктазы. Даследаванне 1976 года з выкарыстаннем мечанай глюкозы паказала, што фарбавальнік стымулюе гексозамонафасфатны шунт, што эфект пры нізкай канцэнтрацыі залежаў ад аксігемаглабіну, а пры вышэйшай канцэнтрацыі, 0.1 mM, утвараўся пераксід вадароду. Адноўлены фарбавальнік пры сустрэчы з кіслародам утварае пераксід, а не фасфатныя сувязі.

У мітахондрыях карціна больш спрэчная, чым прызнаюць папулярныя агляды. Адзін кірунак даследаванняў сцвярджае, што фарбавальнік забірае электроны ў вобласці комплексу I і перадае іх цытахрому c. У іншай працы выявілі, што ў мітахондрыях мозгу мышы ён не можа аднавіць дыханне пасля блакавання антыміцынам, і замест гэтага вызначылі месца прыёму электронаў як участак звязвання ўбіхінолу ў комплексе III. Трэцяя праца паказала, што нізкія канцэнтрацыі павялічвалі спажыванне кіслароду ў стане спакою, але не змянялі дыханне, стымуляванае ADP. Найбольш прамая фармулёўка сутнасці такая: спажыванне кіслароду, выкліканае метыленавым сінім, увогуле не залежыць ад акісляльнага фасфарылявання — яно захоўвалася пры прыгнятанні дыхальнага ланцуга і ў прэпаратах, дзе такога ланцуга не было.

Існуюць і прамыя вымярэнні разыходжання паміж гэтымі дзвюма велічынямі. У ізаляваных мітахондрыях печані пацука павышэнне канцэнтрацыі фарбавальніка зніжала каэфіцыенты дыхальнага кантролю і выклікала набраканне, што аўтары апісалі як раз’яднанне акісляльнага фасфарылявання. У печані пацука, праз якую прапускалі перфузійны раствор, метыленавы сіні павялічваў спажыванне кіслароду, тады як суадносіны ATP і ADP зніжаліся.

Клінічныя даныя нясуць той самы сэнс. Метгемаглабінемію лечаць прыкладна адным–двума міліграмамі метыленавага сіняга на кілаграм нутравенна праз NADPH-залежны шлях аднаўлення, а большыя дозы выклікаюць той самы стан, які лечаць. У тым жа аглядзе адзначана, што антыдотны эфект найбольшы ў непашкоджаных эрытрацытах і слабее пры гемолізе. Гэта вынік пра гемоліз з 1930 года, які зноў з’явіўся праз семдзесят тры гады ў бальнічным кантэксце. Калі карысныя і шкодныя эфекты злучэння ляжаць па розныя бакі парогавай дозы, яго дозу нельга выводзіць з вымярэння спажывання кіслароду.

Чаму ў гэтай размове важная партыя

Хэрап і Бэран заўважылі нешта, што варта прачытаць яшчэ раз. Сам метыленавы сіні дае ў спектраскопе паласу паміж дзвюма характэрнымі палосамі метгемаглабіну, «што лёгка можа выклікаць блытаніну пры павярхоўным аглядзе». Фарбавальнік можа імітаваць рэчыва, якое шукаюць.

Тая самая праблема мае і хімічную форму. Роднасны фенатыязін, прысутны як мінорны кампанент, мае ўласныя акісляльна-аднаўленчыя паводзіны, уласную пранікальнасць і ўласную таксічнасць. Адзін задакументаваны выпадак наглядна паказвае, што пастаўлена на карту: у даследаванні ёдавання метыленавага сіняга ўзоры, якія змяшчалі прыкладна 7–8 працэнтаў Azure B, утваралі пераважна ёдаваны Azure B. Такім чынам, у рэакцыі дамінавала прымесь, а не метыленавы сіні.

Кожны, хто выкарыстоўвае метыленавы сіні як рэактыў — у лабараторыі, пры афарбоўванні прэпаратаў або ў акварыуме, — працуе з інгрэдыентам нявызначанага складу, калі партыя не была ахарактарызаваная. Роднасныя рэчывы, ідэнтычнасць, элементныя прымесі, рэшткавыя растваральнікі і астатак пасля пракальвання — гэта частка эксперыменту, а не проста дакументы вакол яго. Blupreme атрымлівае метыленавы сіні ад фармацэўтычнага вытворцы і публікуе поўны сертыфікат аналізу, правяраючы ўсю спецыфікацыю USP, а не толькі цяжкія металы; дапаможнік па чытанні сертыфіката аналізу і артыкул што пацвярджае і чаго не пацвярджае абазначэнне якасці USP тлумачаць, як супаставіць дакумент з заяўленымі ўласцівасцямі.

Лічба была правільная

Эксперыменты 1928 і 1930 гадоў былі стараннымі, і іх галоўнае назіранне вытрымала праверку часам: фарбавальнік, здольны да аднаўлення, можа прымусіць клетку, якая амаль не дыхае, спажываць кісларод у шмат разоў хутчэй, чым у стане спакою, абмінаючы этап, які блакуе цыянід.

Памылка ўзнікае пазней, калі «дыханне» разумеюць у яго сучасным сэнсе. Вымярэнне газаабмену кажа, што электроны дасягнулі кіслароду. Яно не кажа, што хоць якія-небудзь з іх былі выкарыстаныя для ўтварэння ATP, а ў клетцы без мітахондрый розніца паміж гэтымі двума сцверджаннямі максімальная. Шырэйшая карта дзеяння метыленавага сіняга ў клетках змяшчае гэтае адрозненне ў шырэйшы кантэкст, а гісторыя злучэння ад фарбавальніка да лекавага сродку тлумачыць, як тэкстыльны фарбавальнік увогуле трапіў у гэтыя эксперыменты.