Metilen mavisi və mitoxondrilər: elektron daşınması və sübutlar

Yan-yana iki preparat təsəvvür edin. Hər ikisində tənəffüs zəncirinin Kompleks I hissəsini bloklayan kimyəvi maddə — rotenonla zəhərlənmiş beyin mitoxondriləri var. Təcrübəçi onlardan birinə pipetlə mikromolyar dozada metilen mavisi əlavə edir. Oksigen sərfi qismən bərpa olunur. Membran potensialı qismən geri qayıdır. Az miqdarda ATP sintezi yenidən başlayır. Yan küvetdə isə peroksid sensoru mənzərənin digər yarısını göstərir: sınaqdan keçirilmiş hər dozada və hər substratla hidrogen peroksid hasilatı bir neçə dəfə artıb.

Hər iki göstərici doğrudur. Metilen mavisi tənəffüs zəncirinin zədələnmiş hissəsindən yan keçərək elektron axınını davam etdirə bilən daşıyıcıdır; eyni daşıyıcı bunu edərkən peroksid artımı şəklində əlavə yük də yaradır. Hər iki faktı birlikdə nəzərə aldıqda metilen mavisinin mitoxondrial funksiyaya təsiri barədə ədəbiyyat aydınlaşır. Yalnız birini nəzərə aldıqda isə ilk oxuduğunuz məqalədən asılı olaraq bu təsir möcüzə və ya təhlükə kimi görünür.

Daşıyıcının sadə izahı

Tənəffüs zənciri ardıcıl ötürmə xəttidir. Elektronlar Kompleks I-də (NADH-dan) və ya Kompleks II-də və əlaqəli flavin fermentlərində (suksinatdan və oxşar donorlardan) zəncirə daxil olur, Kompleks III-dən keçərək hərəkətli daşıyıcı sitoxrom c-yə, sonra isə Kompleks IV-dən keçərək oksigenə çatır. Hər ötürmə protonları daxili membrandan keçirir və yaranan qradiyent ATP sintezini hərəkətə gətirir. İstənilən məntəqəni bloklasanız, ondan əvvəlki hissədə axın dayanır.

Metilen mavisi bu prosesə paralel kuryer kimi qoşulur. Onun oksidləşmiş forması zəncirin əvvəlki hissəsindəki daşıyıcılardan elektronları qəbul edərək rəngsiz reduksiya olunmuş formaya — leykometilen mavisinə çevrilir. Bu forma sonra elektronları zəncirin sonrakı hissəsinə ötürür və yenidən mavi olur. İki forma redoks cütünün izahında təsvir olunur, daha geniş ötürmə davranışı isə ümumi mexanizmin izahında təqdim edilir. Açıq qalan sual kuryerin zəncirə harada qayıtmasıdır: Kompleks III-ün Qo sahəsi kimi tanınan xinol bağlanma cibində, yoxsa birbaşa sitoxrom c-də? Hansı çıxışın üstünlük təşkil etməsi şəraitdən asılıdır; Kompleks III-dən yan keçmənin təhlili bunu ətraflı izah edir.

Gəmiricilər üzərində üç tədqiqat əslində nəyi ölçüb

Hər üç tədqiqatda təcrid olunmuş beyin mitoxondrilərindən, yəni hüceyrədən çıxarılıb tərkibi müəyyən edilmiş buferdə suspenziya halında saxlanılan orqanellərdən istifadə olunub. Bütöv hüceyrələr, maddə verilmiş heyvanlar və insan iştirakçılar olmayıb. Konsentrasiyalar insanın ağızdan qəbul etdiyi dozaya deyil, orqanelləri əhatə edən məhlula aiddir. Bu çərçivəni nəzərdə saxladıqda rəqəmlər aydın danışır.

İlk tədqiqat 100 nanomolyardan 2 mikromolyara qədər konsentrasiyalarda təcrid olunmuş dəniz donuzu beyin mitoxondrilərində faydanı və əlavə yükü eyni preparatda ölçüb. Sağlam mitoxondrilərdə boya sakit vəziyyətdə oksigen sərfini artırıb, lakin ADP ilə stimullaşdırılmış tənəffüsü dəyişməyib; buna görə əlaqələnmiş ATP hasilatı yaxşılaşmayıb. Kompleks I bloklandıqda 2 mikromolyar konsentrasiya ATP sintezini dəqiqədə hər milliqram üçün 46 nanomoldan 93 nanomola yüksəldib, normal sürət isə təxminən 1109 olub. Kompleks III bloklandıqda eyni doza ATP sintezini təxminən 46-dan 63-ə yüksəldib, normal sürət isə təxminən 910 olub. Potensial və kalsiumun qəbul edilməsi qismən bərpa olunub. Kompleks IV-ün sianidlə bloklanmasından yan keçmək mümkün olmayıb; bu, faydalı elektron çıxışının işlək Kompleks IV-dən əvvəl yerləşdiyini göstərir. Hər bərpa statistik baxımdan real, lakin kiçik olub: normal ATP hasilatının birrəqəmli faizləri qədər.

İkinci tədqiqat təxminən 1 mikromolyar konsentrasiyada siçanın beyin qabığının mitoxondrilərində Kompleks I-dən yan keçməni təsdiqləyib və Kompleks III-də sərhəd müəyyən edib. Rotenon tənəffüsü dəqiqədə hər milliqram üçün təxminən 121 nanomol oksigendən 2 nanomoldan da aşağı səviyyəyə endirib, boya isə onu təxminən 21-ə, yəni normalın təqribən altıda birinə yüksəldib; eyni zamanda membran potensialı demək olar ki, tam bərpa olunub. Lakin Kompleks III bloklandıqdan sonra 1–5 mikromolyar aralığında nə tənəffüs, nə də potensial bərpa olunub və blokada boyanın yaratdığı peroksid siqnalını zəiflədib. Müəlliflər reduksiya olunmuş boyanın elektronlarını Kompleks III-ün Qo sahəsinə ötürdüyünü irəli sürüblər: həmin sahə tutulduqda kuryerin yükünü çatdıracağı yer qalmır.

Üçüncü tədqiqat əsasən 2 mikromolyar konsentrasiyada siçan, siçovul və dəniz donuzu beyin mitoxondrilərində bu fikir ayrılığını birbaşa yoxlayıb və Kompleks III blokadasından yan keçməyin mümkün olduğunu müəyyən edib. Qo sahəsinin inhibitoru miksotiazol bazal tənəffüsü 88 faiz azaltdıqda boya oksigen sərfini bloklanmamış sürətin təxminən 62 faizinə qədər bərpa edib. Birbaşa sınaqda yarım mikromolyar konsentrasiya hətta Kompleks III bloklanmış halda belə kənardan əlavə edilmiş sitoxrom c-ni reduksiya edib. Bu, NADH-dan boya vasitəsilə sitoxrom c-yə, oradan da Kompleks IV-ə uzanan yolu dəstəkləyir. Lakin bərpa olunmuş tənəffüs qeyri-normal davranıb: əlavə edilən ADP oksigen sərfini artırmaq əvəzinə azaldıb, ATP sintezinin bloklanması isə tənəffüsü stimullaşdırıb. Potensial yalnız qismən repolyarizasiya olunub. Əlaqələnmənin tərsinə çevrildiyi halda yüksək oksigen sərfi normal enerji istehsalı deyil.

Laboratoriyaların nəticələri niyə fərqlənir və məsələni nə aydınlaşdırır

İlk olaraq növ fərqi ilə verilən izah özünü doğrultmur. Üçüncü qrup işi üç gəmirici növündə təkrarlayıb və hamısında, o cümlədən əvvəllər yan keçmənin olmadığı bildirilmiş siçan xəttində eyni keyfiyyət xarakterli yan keçmə nəticəsini alıb. Əsl fərqlər konsentrasiyada (1 və 2 mikromolyar), inhibitor dozalarında, buferlərdə, təcridetmə üsullarında və hər şeydən əvvəl müqayisə edilən enerji vəziyyətindədir: yan keçmə ən aydın şəkildə ADP əlavə edilməzdən əvvəl, məhz paradoksal ADP reaksiyasının ortaya çıxdığı vəziyyətdə görünür. Buna görə dürüst diaqram şəraitdən asılı iki çıxışı göstərir: biri Qo sahəsində, digəri sitoxrom c-də. Kuryer yükünü yerli kimyəvi şəraitin imkan verdiyi yerə çatdırır.

Peroksid yükü

Əlavə yükə dair nəticələr bərpaya dair nəticələr qədər ardıcıldır. Dəniz donuzları ilə aparılmış işdə boya yoxlanılan bütün şəraitlərdə — sakit vəziyyətdə, ATP sintezi zamanı və kimyəvi yolla pozulmuş vəziyyətdə — hər üç substratla peroksid ayrılmasını artırıb. ATP sintezi zamanı 1 mikromolyar konsentrasiyada hasilat dəqiqədə hər milliqram üçün təxminən 148 pikomoldan 1500 pikomoldan yuxarı səviyyəyə qalxıb; hətta 100 nanomolyar konsentrasiya belə siqnalı dörd dəfədən çox artırıb. Boya həmçinin peroksidin kənarlaşdırılmasını təxminən 2.6 dəfə ləngidib; buna görə siqnal həm daha sürətli əmələ gəlməni, həm də daha yavaş kənarlaşdırılmanı əks etdirir. Təklif olunan kimyəvi izah aşkarlana bilən superoksid olmadan oksigenin reduksiya olunmuş boya tərəfindən birbaşa reduksiyasıdır, lakin bu, sübut edilmiş mərhələ deyil, hələlik şərh olaraq qalır.

Siçanlarla aparılmış iş mənzərəni faydalı şəkildə mürəkkəbləşdirir. Peroksid doza artdıqca kəskin yüksəlib: 2 mikromolyar konsentrasiyada dəqiqədə hər milliqram üçün təxminən 76 pikomolluq başlanğıc səviyyədən təxminən 2000 pikomola çatıb. Bununla belə, Kompleks III blokadası boyanın yaratdığı hissəni zəiflədib. Peroksid yalnız reduksiya olunmuş boyanın oksigenlə reaksiyasından yaransaydı, zəncirin bloklanmasının bu qədər təsiri olmamalı idi. Amma təsiri var, deməli, zəncir də prosesdə iştirak edir. Antioksidant və prooksidant təsirlərin icmalı bu ikiliyi daha geniş kontekstdə təqdim edir, oksigen və ATP-nin müqayisəli təhlili isə təkcə oksigen göstəricilərinin niyə enerji ilə bağlı iddianı heç vaxt təsdiqləyə bilmədiyini izah edir.

Funksiyanın bərpası təmir deyil

İstifadədən çıxarılmalı ifadə budur: "metilen mavisi mitoxondriləri təmir edirmi?" Təmir davamlı düzəliş demək olardı: yenidən qurulmuş komplekslər, maddə uzaqlaşdıqdan sonra da davam edən əlaqələnmə, bütöv hüceyrələrdə bərpa və daha sonra canlı orqanizmdə funksiyanın yaxşılaşması. Üç məqalənin heç biri bunu göstərmir. Onlar süni kimyəvi blokada zamanı yenicə təcrid olunmuş orqanellərdə elektron axınının dərhal başqa yola yönəldilməsini göstərir; ATP hasilatı normalın yalnız kiçik hissəsinə bərabər olur və əlaqələnmə bəzən açıq-aşkar qəribə davranır. Rotenon və antimisin laboratoriya alətləridir, qocalmanın və ya insan mitoxondrial xəstəliyinin modelləri deyil. Buradakı heç bir nəticə sağlam insan üçün daha çox enerji demək deyil; bu, insanlarla aparılmış tədqiqatlardan ibarət ayrıca ədəbiyyatı olan ayrı bir sübut məsələsidir.

Üç sərhəd biohakinqə dair istənilən nəticənin dürüst qalmasını təmin edir. Birincisi, məhluldakı konsentrasiya doza deyil: təcrid olunmuş orqanellərin ətrafında 0.1–2 mikromolyar konsentrasiya insanın beyin mitoxondrisində həmin sərbəst konsentrasiyanı ağızdan qəbul edilən hansı miqdarın yaradacağı barədə heç nə demir. Üstəlik, boyanın toplanması və ya buraxılması membran potensialının özündən asılıdır. İkincisi, oksigen enerji deyil: boya məhsuldar fosforlaşma ilə yanaşı dövri reaksiyalar və sızma vasitəsilə də oksigen sərfini artıra bilər; buna görə ATP və potensial ölçmələri olmadan respirometriya enerji ilə bağlı iddiaya əsas vermir. Üçüncüsü, fayda və yük eyni cümlədə yer almalıdır: potensialın və ya ATP-nin bərpası barədə yanaşı baş verən peroksid artımını qeyd etməyən hər hansı ifadə təcrübəni yanlış təqdim edir. Əlaqəli məhdudlaşdırıcı amillərə NAD redoks balansı, doza–cavab əyrisinin forması və ölçmə sınaqları üzrə bələdçi daxildir.

Bir praktik qeyd: elektron daşıma qabiliyyəti məhz bu molekulun xüsusiyyətidir. Azure B kimi demetilləşmiş qohum birləşmələr də redoks baxımından aktivdir, lakin fərqli davranır; buna görə qismən parçalanmış məhlulla aparılan təcrübə bütöv boya ilə aparılan təcrübədən fərqlidir. Bu, yalnız metalların yoxlanması ilə kifayətlənmək əvəzinə tam farmakopeya spesifikasiyasını və dərc olunmuş partiya sənədini tələb etməyin səbəblərindən biridir. İşığın yaratdığı kimyəvi reaksiyalar işıqlandırılan tətbiqlər üçün əlavə bir məhdudiyyət yaradır; bu məsələ qırmızı işıqla kombinasiyalar bölməsində izah olunur.

Dar çərçivəli iddia bütün bunlardan sonra da qüvvədə qalır və onu saxlamağa dəyər: metilen mavisi zədələnmiş, təcrid olunmuş mitoxondrilərdə şəraitdən asılı elektron kuryeri kimi fəaliyyət göstərə və peroksid yükü hesabına axını qismən qoruya bilər. Bundan kənar hər şey — enerji, uzunömürlülük, təmir — bu tədqiqatların təqdim etmək üçün heç vaxt nəzərdə tutulmadığı sübutları gözləyir.