Die eksperimente wat metileenblou met sellulêre respirasie verbind het

Gedefibrineerde menslike bloed wat vir drie uur tot 37 °C verwarm word, verbruik ongeveer twee persent van die suurstof wat dit bevat. Voeg ’n klein hoeveelheid metileenblou voor die inkubasie by, en dieselfde bloed verbruik ongeveer vyf-en-sestig persent. Niks aan die selle het verander nie. Net die oplossing het.

Daardie syfer kom uit ’n artikel van 1928 deur George Harrop en E. S. Guzman Barron by Johns Hopkins, en dit is die oorsprong van die wyd herhaalde stelling dat metileenblou sellulêre respirasie verbeter. Die stelling is nie onwaar nie, maar die betekenis daarvan is enger as wat dit klink.

Wat die syfer in die tabel werklik meet

Die eindpunt was suurstofopname, bepaal deur gasontleding. Harrop en Barron het pas getapte bloed by 10 °C deur watte gefiltreer om die witbloedselle te verwyder, die monster met suurstof versadig, dit verdeel, kleurstof by een gedeelte gevoeg en albei ná inkubasie ontleed. Leukosiettellings het selde ongeveer ’n duisend per kubieke millimeter oorskry. Suurstofverbruik is gerapporteer as die deel van die monster se aanvanklike suurstofinhoud wat verdwyn het.

Hulle het ook koolstofdioksied gemeet, maar daar het die metode probleme opgelewer. Gedefibrineerde bloed het in die eerste uur van inkubasie tot twee millimol koolstofdioksied per 100 mL vrygestel om redes wat nie met die reaksie onder studie verband gehou het nie, sodat respiratoriese kwosiënte uit volbloed onbruikbaar was. Slegs gewaste selle in Locke se oplossing het interpreteerbare syfers gelewer, en dié was tussen 0.73 en 0.80 gegroepeer, met en sonder die kleurstof.

Daardie besonderheid is nie onbenullig nie. “Respirasie” in hierdie artikels beteken gaswisseling in ’n geslote houer. Die gaping tussen suurstofverbruik en nuttige energie-uitset word afsonderlik ondersoek in wat suurstofverbruik jou oor ATP vertel en nie vertel nie.

Die kleurstof het die meeste bygedra waar die selle die minste gerespireer het

Volwasse soogdiereritrosiete het byna geen meetbare suurstofverbruik nie. Voëleritrosiete met selkerne het wel. Harrop en Barron het albei getoets, en die kontras vorm die grondslag van hulle argument.

In die soogdiermonsters het die kleurstof twintig- tot vyftigvoudige toenames veroorsaak. In gansbloed, waarvan die selle reeds gerespireer het, het dit die tempo nooit meer as verdubbel nie. Hoe hoër die aanvanklike respirasie, hoe minder kon die kleurstof bydra.

Dieselfde gradiënt kom binne een spesie voor. ’n Menslike monster van ’n pasiënt met polisitemie vera, wat onvolwasse selle bevat het, het 11.3 persent van sy suurstof sonder kleurstof verbruik, teenoor 2.8 persent vir gewaste selle van ’n gesonde skenker. Kleurstof het dit slegs tot 63.4 persent verhoog, ’n sesvoudige versnelling waar normale selle byna dertigvoudig versnel het. Die kleurstof het volwasse selle meer soos onvolwasse selle laat optree, presies soos die outeurs dit beskryf het.

Sianied moes dit gestop het

Dit was bekend dat sianied sellulêre oksidasie stop. Harrop en Barron het dit nietemin saam met die kleurstof bygevoeg.

Die resultate met beesbloed is verteenwoordigend. Die suurstofinhoud het oor drie uur sonder enige byvoegings van 22.61 tot 22.03 volumeprosent gedaal. Met metileenblou het dit tot 12.84 gedaal. Met metileenblou en kaliumsianied teen een vyfduisendste molaar het dit tot 12.74 gedaal. Die kleurstof se effek was feitlik onaangetas.

Figuur: ’n deurlopende mikrorespirasie-opname van menslike eritrosiete. Die pyl dui die byvoeging van metileenblou aan. Voor dit is die kurwe byna plat; daarna styg dit bestendig. Oorgeneem uit Harrop en Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Hulle gevolgtrekking was dat die kleurstof as ’n suurstofdraer opgetree het deur “’n stof te verskaf wat uit volwasse soogdiere se kernlose eritrosiete verdwyn het.” Twee jaar later het Michaelis en Salomon by die Rockefeller Institute die meningsverskil in sy blywende vorm gestel. Óf die kleurstof se effek was “’n toevallige eienskap van die kleurstof”, óf die kleurstof was “’n model vir ’n onbekende stof in die organismes”. Dié twee moontlikhede is steeds nie beslis nie. Wat wel verander het, is dat die selle nou baie noukeuriger beskryf kan word.

’n Lewerekstrak het dieselfde gedoen

Michaelis en Salomon het getoon dat kouewaterekstrakte van organe dieselfde stimulering veroorsaak. Rotlewer het die sterkste effek gehad, gevolg deur nier, milt en testikel. Brein, spier en bloedserum het min of geen effek gehad nie.

Hulle het toe die ekstrak teen koolstofmonoksied getoets. Respirasie wat deur óf die ekstrak óf die kleurstof opgewek is, was onveranderd in ’n mengsel van 98 persent koolstofmonoksied en 2 persent suurstof. Dieselfde gasmengsel het gisrespirasie en dié van hoendereritrosiete met selkerne met ongeveer 60 tot 80 persent geïnhibeer, in ooreenstemming met Warburg se beskrywing van ’n koolstofmonoksiedsensitiewe respirasieferment. Die ongeïdentifiseerde weefselstof was dus nie Warburg se ensiem nie.

Verskeie moontlike identiteite is gaandeweg uitgeskakel. Gereduseerde glutatioon en sisteïen het slegs die suurstofverbruik veroorsaak wat vir hulle eie oksidasie nodig was. Harden en Young se koënsiem is uitgesluit omdat spier die meeste daarvan bevat, maar byna die kleinste effek getoon het. Keilin se sitochroom, wat ’n paar jaar tevore benoem is, het op dieselfde teenstrydigheid gestuit. Hulle eie voorstel, dat die aktiewe stof uit die selkern kom, het hulle bloot ’n voorstel genoem.

Die effek was aan voorwaardes onderhewig

Die selle moes ongeskonde wees. Hemolise deur gedistilleerde water of herhaalde bevriesing het die reaksie op sowel die kleurstof as die ekstrak uitgeskakel, en gedeeltelike hemolise het dit in verhouding verminder.

Suiker was ook nodig. Glukose, fruktose en sukrose het die kleurstofgeïnduseerde respirasie ondersteun; mannitol het nie. Sonder suiker was daar hoegenaamd geen respirasie nie, en die kleurstof het blykbaar in die proses die selle beskadig, sodat glukose wat een of twee uur later bygevoeg is, dit nie herstel het nie. Die outeurs het voorgestel dat die kleurstof ’n strukturele komponent oksideer wat die sel nodig het.

Beligting het die kleurstof se effek aansienlik verhoog, hoewel die effek ook in die donker duidelik was. Ander reduseerbare kleurstowwe het anders opgetree: tolueenblou het metileenblou geëwenaar of oortref, terwyl indigodisulfonaat byna niks gedoen het nie. Geen duidelike verband het tussen ’n kleurstof se oksidasie-reduksiepotensiaal en die grootte van sy effek na vore gekom nie, wat die outeurs aan membraandeurlaatbaarheid en toksisiteit toegeskryf het.

Die effek het fermentasie gevolg, nie respirasie nie

Barron se studie van 1930 het van selsuspensies na weefselskyfies van normale rotorgane en oorgeplante gewasse verskuif.

In weefsels sonder aërobiese glikolise het metileenblou niks gedoen nie of suurstofverbruik effens onderdruk: nier met ongeveer 14 persent, pankreas met ongeveer 14 persent, lewer met ongeveer 5 persent. In weefsels wat in die teenwoordigheid van suurstof fermenteer, het dit verbruik verhoog: milt met ongeveer 8 persent, brein met ongeveer 13 persent. Toenames in gewasse het gewissel van ongeveer 27 persent in ’n menslike borskarsinoom tot meer as 80 persent in ’n Rous-hoendersarkoom, rofweg in verhouding tot elke weefsel se aërobiese glikolise.

Figuur: elke punt is een weefseltipe. Die horisontale as is aërobiese glikolise; die vertikale as is die verandering in suurstofverbruik ná metileenblou. Data uit Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabel 6, PMID 19869777.

Die sianiedeksperiment het toe die spieëlbeeld opgelewer. Toe respirasie in daardie voorheen onresponsiewe weefsels met sianied geblokkeer is en fermentasie na vore gekom het, het die kleurstof suurstofverbruik weer verhoog: nier met ongeveer 59 persent, lewer met ongeveer 19 persent, milt met ongeveer 286 persent, testikel met ongeveer 200 persent.

Barron het voorgestel dat die kleurstof as ’n toets vir die fermentatiewe vermoë van ’n sel of weefsel kon dien, en met ’n bespiegeling afgesluit: generasies van gewaskultuur in ’n kleurstofbevattende medium sou dalk eendag ’n gewas se metabolisme permanent soos dié van normale weefsel kon maak. Dit was ’n navorsingsvraag wat in 1930 neergeskryf is. Dit is nie ’n aanspraak oor behandeling nie.

Wat die eksperimente nie kon gemeet het nie

In 1928 en 1930 het “respirasie” suurstofverbruik beteken. Adenosientrifosfaat is die eerste keer in 1929 gerapporteer, en die bewys dat geïsoleerde mitochondria fosfaat verester terwyl hulle elektrone oordra, het in 1949 gekom. Geen van die vroeë artikels oor metileenblou kon energieproduksie gemeet het nie, en geen het beweer dat dit gedoen is nie.

Die selle is die tweede probleem. Volwasse soogdiereritrosiete bevat geen mitochondria nie. Gedurende die retikulosietstadium verwyder hulle mitochondria en ribosome deur selektiewe outofagie, en daarom werk ’n volwasse rooibloedsel op glikolise en is dit hoofsaaklik vir NADPH, eerder as vir ATP, van sy pentosefosfaatweg afhanklik. In die eksperimente van 1928 was daar geen elektrontransportketting teenwoordig om te herstel nie. Wat ook al die suurstof verbruik het, was besig met iets anders.

Wat daardie iets anders was, word nou redelik goed beskryf. Metileenblou aanvaar elektrone van sellulêre reduseerekwivalente en word leukometileenblou, wat deur molekulêre suurstof heroksideer word en so die siklus voltooi. In menslike rooibloedselle voer NADPH-afhanklike flavienreduktase en verwante disulfiedreduktases die reduksiestap uit. ’n Studie van 1976 met gemerkte glukose het bevind dat die kleurstof die heksosemonofosfaatroete stimuleer, dat die effek by lae konsentrasies van oksihemoglobien afhanklik was, en dat ’n hoër konsentrasie, 0.1 mM, waterstofperoksied opgewek het. ’n Gereduseerde kleurstof wat suurstof teëkom, produseer peroksied, nie fosfaatbindings nie.

In mitochondria is die prentjie meer omstrede as wat gewilde opsommings erken. Een navorsingsrigting voer aan dat die kleurstof elektrone uit die omgewing van kompleks I neem en aan sitochroom c oordra. ’n Ander het bevind dat dit in muisbreinmitochondria nie respirasie ná ’n antimisiënblokkade kan herstel nie, en het die elektronakseptor eerder by die ubikinolbindingsplek van kompleks III geplaas. ’n Derde het bevind dat lae konsentrasies suurstofverbruik in rus verhoog het, terwyl ADP-gestimuleerde respirasie onveranderd gebly het. Die mees regstreekse formulering van die punt is dat metileenblougeïnduseerde suurstofverbruik hoegenaamd nie van oksidatiewe fosforilering afhanklik is nie: dit het voortgeduur wanneer die respiratoriese ketting geïnhibeer is, en in preparate sonder so ’n ketting.

Daar bestaan ook regstreekse metings van die gaping tussen die twee groothede. In geïsoleerde rotlewermitochondria het toenemende kleurstofkonsentrasies respiratoriese beheerverhoudings verlaag en swelling veroorsaak, wat die outeurs as ontkoppeling van oksidatiewe fosforilering beskryf het. In geperfuseerde rotlewer het metileenblou suurstofverbruik verhoog terwyl die ATP-tot-ADP-verhouding gedaal het.

Die kliniese bevindings dra dieselfde boodskap. Methemoglobinemie word behandel met ongeveer een tot twee milligram metileenblou per kilogram intraveneus, deur middel van ’n NADPH-afhanklike reduksieweg, en groter dosisse veroorsaak die toestand wat behandel word. Dieselfde oorsig merk op dat die teenmiddeleffek die grootste in ongeskonde eritrosiete is en afneem wanneer hemolise teenwoordig is; dit is die hemolisebevinding van 1930 wat drie-en-sewentig jaar later in ’n hospitaalkonteks weer verskyn. ’n Verbinding waarvan die nuttige en skadelike effekte aan teenoorgestelde kante van ’n dosisdrempel lê, is nie ’n verbinding waarvan die dosis uit ’n suurstofverbruikmeting afgelei behoort te word nie.

Waarom die lot deel van die bespreking is

Harrop en Barron het iets opgemerk wat ’n tweede lees werd is. Metileenblou self produseer ’n band in die spektroskoop tussen die twee kenmerkende bande van methemoglobien, “wat maklik verwarring by ’n vlugtige ondersoek kan veroorsaak”. Die kleurstof kan die stof naboots waarna gesoek word.

Dieselfde probleem het ’n chemiese vorm. ’n Verwante fenotiasien wat as ’n geringe bestanddeel teenwoordig is, het sy eie redoksgedrag, sy eie deurlaatbaarheid en sy eie toksisiteit. Een gedokumenteerde geval maak die belang daarvan konkreet: in ’n studie oor die jodering van metileenblou het monsters wat ongeveer 7 tot 8 persent Azure B bevat het, hoofsaaklik gejodeerde Azure B opgelewer, sodat die onsuiwerheid eerder as die metileenblou die reaksie oorheers het.

Enigiemand wat metileenblou as ’n reagens gebruik, in ’n laboratorium, by ’n kleurwerkbank of in ’n akwarium, werk met ’n ongespesifiseerde bestanddeel tensy die lot gekarakteriseer is. Verwante stowwe, identiteit, elementêre onsuiwerhede, oorblywende oplosmiddels en die residu ná uitgloeiing is deel van die eksperiment, eerder as bloot die papierwerk daaromheen. Blupreme verkry sy metileenblou van ’n farmaseutiese vervaardiger en publiseer ’n volledige ontledingsertifikaat, met toetsing volgens die hele USP-spesifikasie eerder as slegs vir swaar metale; die gids om ’n ontledingsertifikaat te lees en wat die USP-graadaanduiding wel en nie bevestig nie verduidelik hoe om die dokument teen die aanspraak te toets.

Die syfer was reg

Die eksperimente van 1928 en 1930 is noukeurig uitgevoer, en hulle kernwaarneming het standgehou: ’n reduseerbare kleurstof kan ’n sel wat skaars respireer, suurstof teen baie keer sy rustempo laat verbruik, sonder om deur die stap te gaan wat sianied blokkeer.

Die fout verskyn later, wanneer “respirasie” volgens sy moderne betekenis gelees word. ’n Gaswisselingsmeting vertel jou dat elektrone suurstof bereik het. Dit vertel jou nie dat enige van hulle gebruik is om ATP te maak nie, en in ’n sel sonder mitochondria is die afstand tussen daardie twee stellings so groot as wat dit kan wees. Die breër oorsig van wat metileenblou in selle doen plaas dieselfde onderskeid in ’n wyer raamwerk, en die geskiedenis van die verbinding van kleurstof tot medisyne verduidelik hoe ’n tekstielkleurstof in die eerste plek by hierdie eksperimente beland het.