Xanh methylen và ferroptosis: cơ chế peroxy hóa lipid

Ferroptosis là sự chết tế bào do tổn thương màng. Các chất béo không bão hòa đa trong màng bị oxy hóa theo phản ứng dây chuyền, màng mất chức năng và tế bào chết. Quá trình hóa học này cần có sắt. Câu đó tóm gọn toàn bộ khái niệm, và mọi nội dung trong bài viết này đều là phép kiểm nghiệm một phần của khái niệm ấy.

Câu hỏi ở đây hẹp hơn: xanh methylen tác động thế nào đến chuỗi này trong các thí nghiệm tế bào, và kết quả đó thực sự cho thấy điều gì. Câu trả lời ngắn gọn là trong hai nghiên cứu phòng thí nghiệm, xanh methylen ở nồng độ nanomolar làm giảm peroxy hóa lipid ty thể và duy trì sự sống của tế bào sau khi tiếp xúc với các tác nhân vốn gây ferroptosis. Câu trả lời đầy đủ quan trọng hơn, vì mỗi mắt xích trong chuỗi được kiểm nghiệm bằng một biện pháp can thiệp khác nhau, và mỗi biện pháp đều có giới hạn.

Ferroptosis trong một đoạn văn

Một phospholipid màng mang đuôi axit béo không bão hòa đa có một điểm yếu: các nguyên tử hydro dễ bị lấy đi. Khi một gốc tự do lấy đi một nguyên tử hydro, oxy gắn vào lipid, một gốc peroxyl lipid hình thành, rồi gốc này lại lấy hydro từ lipid kế tiếp. Phản ứng lan truyền dọc theo màng nếu không có yếu tố ngăn chặn.

Yếu tố ngăn chặn chính là một enzyme gọi là GPX4, sử dụng glutathione để khử các peroxide lipid thành alcohol lipid vô hại. Các tác nhân gây ferroptosis trong phòng thí nghiệm tấn công hệ thống phòng vệ này tại những vị trí xác định. Erastin chặn sự vận chuyển cystine vào tế bào qua hệ thống xc-minus, khiến tế bào thiếu cysteine để tổng hợp glutathione. Buthionine sulfoximine trực tiếp chặn quá trình tổng hợp glutathione. RSL3 ức chế chính GPX4. Cả ba đều khiến peroxide không được loại bỏ, nhưng tác động ở các bước khác nhau, nên kết quả với một tác nhân không thể tự động khái quát sang các tác nhân còn lại.

Ferroptosis khác với apoptosis ở những đặc tính xác định nó. Không có chuỗi hoạt hóa caspase và không có thể apoptotic. Các chất tạo phức chelat với sắt như deferoxamine và các chất bẫy gốc tự do như ferrostatin-1 ức chế quá trình này; đây là phép kiểm nghiệm thực nghiệm mà các nhà nghiên cứu sử dụng để xác định một trường hợp chết tế bào là do ferroptosis, chứ không chỉ là hoại tử. Bức tranh rộng hơn về các con đường chết tế bào có điều hòa giúp đặt sự khác biệt này vào bối cảnh, còn cách tế bào xử lý sắt linh động giải thích vì sao việc tạo phức chelat lại là một đối chứng mang tính quyết định.

Vai trò của ty thể và vì sao vai trò đó từng gây tranh luận

Các nghiên cứu ban đầu ghi nhận rằng tế bào không có DNA ty thể vẫn trải qua ferroptosis, cho thấy ty thể có thể không phải thành phần bắt buộc. Các nghiên cứu sau đó phát hiện rằng việc làm giảm số lượng ty thể hoặc chặn hô hấp có thể ức chế ferroptosis do thiếu cysteine, nhưng không ức chế ferroptosis do ức chế trực tiếp GPX4. Cả hai kết quả đều có thể đúng nếu đóng góp của ty thể phụ thuộc vào tác nhân khởi phát, loại tế bào và nơi diễn ra quá trình peroxy hóa mang tính quyết định.

Nghiên cứu làm nền tảng cho bài viết này tiếp cận tranh luận bằng một đầu dò đặc hiệu cho từng ngăn tế bào. MitoCLox là phiên bản nhắm đích ty thể của một đầu dò báo cáo peroxy hóa lipid: tín hiệu huỳnh quang của nó thay đổi khi gặp các gốc peroxyl lipid bên trong ty thể. Ở nguyên bào sợi được xử lý bằng erastin, sự oxy hóa đầu dò ty thể xuất hiện trong các tế bào còn sống trước khi chúng chết, và không đồng nhất trong quần thể tế bào. Thời điểm này rất quan trọng. Peroxy hóa xảy ra trước khi tế bào chết là một nguyên nhân tiềm năng. Peroxy hóa chỉ đo được ở tế bào đã chết là dấu vết sau tổn thương. Hướng dẫn đi kèm về các phép thử peroxy hóa lipid và tín hiệu mà từng đầu dò phản ánh giải thích vì sao vị trí của đầu dò quyết định ý nghĩa của tín hiệu.

Mô hình thứ hai cũng cho thấy cùng một diễn biến. Nguyên bào sợi từ một bệnh nhân mắc bệnh thần kinh thị giác di truyền Leber, mang đột biến phức hợp I và có mức stress oxy hóa nền cao hơn, chết do ferroptosis khi glutathione bị suy giảm, trong khi nguyên bào sợi đối chứng có khả năng chống chịu. Sự oxy hóa đầu dò ty thể một lần nữa xuất hiện trước. Chi tiết có trong nghiên cứu trên nguyên bào sợi về peroxy hóa lipid ty thể trong ferroptosis.

Xanh methylen đã thay đổi điều gì trong các thí nghiệm này

Xanh methylen là một chất mang oxy hóa–khử. Dạng oxy hóa của nó nhận electron từ các phản ứng liên quan đến NADH tại phức hợp I, còn dạng khử truyền electron cho cytochrome c, chất chuyển electron đến phức hợp IV. Điều này tạo ra một đường đi tắt một phần qua đoạn chuỗi nơi electron thường rò rỉ sang oxy để tạo superoxide. Độc giả muốn hiểu đầy đủ quá trình chuyển tiếp này nên bắt đầu với cách xanh methylen chuyển electron qua ty thể.

Ở nguyên bào sợi phổi được xử lý bằng erastin, xanh methylen ở nồng độ 250 nanomolar duy trì khả năng sống trong phép đo sự sống sót của tế bào, tương tự các chất chống oxy hóa nhắm đích ty thể SkQ1 và MitoTEMPO. Các đối chứng xác định phạm vi của nhận định này. Ferrostatin-1, alpha-tocopherol và deferoxamine cũng có tác dụng bảo vệ, xác nhận rằng sự chết tế bào là do ferroptosis. Chất tương tự SkQ1 không có nhóm chống oxy hóa không có tác dụng bảo vệ, gợi ý vai trò của phản ứng oxy hóa–khử thay vì sự tích tụ không đặc hiệu. Tác dụng bảo vệ giảm dần khi nồng độ SkQ1 vượt khoảng 200 nanomolar, phù hợp với đặc tính thúc đẩy oxy hóa đã biết của các chất chống oxy hóa quinone ở mức cao hơn. Xanh methylen cũng có tác động hai mặt phụ thuộc nồng độ: bảo vệ ở nồng độ nanomolar thấp trong các đĩa nuôi cấy này, nhưng có khả năng tạo hydrogen peroxide qua chu trình oxy hóa–khử khi nồng độ tăng cao hoặc khi được chiếu sáng mạnh. Bối cảnh nồng độ như vậy được trình bày trong bài về các dạng oxy phản ứng trong ty thể.

Các thí nghiệm trên ty thể phân lập sau đó đã phân biệt các nguồn ROS. Khi có sắt hóa trị II, các cơ chất cung cấp electron cho phức hợp I kết hợp với rotenone thúc đẩy sự oxy hóa đầu dò. Rotenone chặn dòng electron ở phía sau vị trí flavin, nên các chất mang phía trước vẫn ở trạng thái khử và làm rò rỉ electron sang oxy từ flavin hướng về chất nền ty thể. Các cơ chất cung cấp electron cho phức hợp III kết hợp với antimycin A tạo ra nhiều hydrogen peroxide nhưng không thúc đẩy peroxy hóa lipid. Cùng một tín hiệu ROS tổng thể, nhưng vị trí khác nhau dẫn đến kết quả khác nhau. Cả SkQ1 và xanh methylen đều ức chế peroxy hóa do phức hợp I thúc đẩy mà không ức chế chính quá trình tạo hydrogen peroxide, cho thấy chúng tác động sau khi ROS hình thành, tại bước peroxy hóa lipid.

Nhánh nghiên cứu quá tải sắt và manh mối từ lipofuscin

Một nghiên cứu thứ hai đặt câu hỏi từ phía sắt. Các tế bào cơ tim H9c2 tiếp xúc với ferric ammonium citrate ở nồng độ dưới millimolar lần lượt xuất hiện ROS ty thể, peroxy hóa lipid ty thể, rồi ferroptosis, sau đó tích tụ một sắc tố giống lipofuscin trong vòng 24 giờ. Lipofuscin là phần tồn dư tự phát huỳnh quang, chứa sắt, của lipid và protein bị oxy hóa, tích tụ theo tuổi tác; sự xuất hiện nhanh chóng của nó ở đây liên hệ quá trình peroxy hóa cấp tính do sắt thúc đẩy với một dấu ấn lão hóa kinh điển. Cả xanh methylen ở nồng độ nanomolar và SkQ1 đều ngăn peroxy hóa, chết tế bào và tích tụ sắc tố. Ty thể tim phân lập xác nhận diễn biến này: rotenone kết hợp với sắt hóa trị II thúc đẩy peroxy hóa và tín hiệu giống sắc tố, còn cả hai chất đều chặn quá trình đó. Toàn bộ chuỗi diễn biến được báo cáo trong nghiên cứu quá tải sắt ở tế bào cơ tim H9c2. Khía cạnh sắc tố của vấn đề này gắn với lipofuscin và các dấu ấn lão hóa tế bào.

Những điều phép thử sự sống sót của tế bào không cho thấy

Một phép đo khả năng sống như CellTiterBlue cho biết có bao nhiêu tế bào trong đĩa vẫn duy trì hoạt động chuyển hóa sau khi tiếp xúc với một tác nhân khởi phát cùng một chất bảo vệ tiềm năng. Đó là phép kiểm nghiệm cơ chế trong một hệ thống xác định. Nó không phải kết quả điều trị. Không thí nghiệm nào trong số này cho bệnh nhân dùng chất thử, đo tiêu chí đánh giá bệnh hay xác lập khoảng điều trị trong cơ thể.

Có bốn giới hạn cần nêu rõ. Thứ nhất, phạm vi loại tế bào rất hẹp: nguyên bào sợi phổi đã biến đổi, nguyên bào sợi da nguyên phát bao gồm một dòng mang bệnh ty thể, một dòng tế bào cơ tim chuột cống, cùng ty thể tim chuột cống phân lập. Độ nhạy khác nhau giữa các dòng, và dòng LHON được lựa chọn vì đặc tính dễ bị tổn thương bất thường. Thứ hai, các tác nhân khởi phát là những điều kiện cực đoan trong phòng thí nghiệm: chặn hoàn toàn vận chuyển hoặc tổng hợp, và lượng sắt mà không mô nào gặp phải trong thời gian ngắn. Thứ ba, không thể quy đổi nồng độ chỉ bằng phép nhân. Nồng độ nanomolar trong môi trường nuôi cấy không phải liều dùng cho người; sự phân bố xanh methylen, quá trình khử thành dạng không màu trong máu và mô, mức tiếp xúc ánh sáng và điện thế màng đều là những yếu tố nằm giữa đĩa nuôi cấy và con người. Thứ tư, các đầu dò chỉ phản ánh ngăn tế bào của chính chúng. Sự oxy hóa MitoCLox cho thấy các gốc lipid đã hình thành trong ty thể; nó không cho thấy hiện tượng vỡ màng sinh chất, vốn có khả năng là sự kiện cuối cùng, được ngăn chặn trực tiếp hay được tránh nhờ can thiệp ở thượng nguồn.

Vì vậy, nhận định trung thực là: trong các mô hình này, ROS có nguồn gốc từ phức hợp I cùng với sắt thúc đẩy peroxy hóa lipid ty thể xảy ra trước ferroptosis, và xanh methylen ở nồng độ thấp ngắt đoạn này. Mọi kết luận vượt ra ngoài đoạn đó đều cần các thí nghiệm khác trên động vật, rồi đến con người.