Xanh methylen có thể đi vòng qua Phức hợp III của ty thể không? Vì sao các nghiên cứu bất đồng

Hai phòng thí nghiệm đặt câu hỏi liệu xanh methylen có thể đi vòng qua Phức hợp III bị chặn của ty thể hay không. Một bên trả lời không. Bên kia trả lời có. Cả hai đều có dữ liệu.

Nghiên cứu đầu tiên, trên ty thể não chuột nhắt, cho thấy chất màu này không làm được. Nghiên cứu thứ hai, trên ty thể não của ba loài gặm nhấm, cho thấy nó có thể làm được một phần. Nghiên cứu thứ ba, trên gan chuột nhắt, thường được trích dẫn cùng hai nghiên cứu này nhưng thực ra kiểm tra một vấn đề khác. Đặt nó đúng vào phạm vi của mình sẽ giải tỏa được một nửa sự nhầm lẫn.

Không có cơ chế phổ quát nào để công bố ở đây. Có ba thí nghiệm với các chất chặn, liều và chỉ số đo khác nhau. Hãy đọc điều kiện trước. Kết luận sẽ theo sau.

Đi vòng có nghĩa là gì ở đây

Electron đi vào chuỗi qua Phức hợp I (từ NADH) hoặc Phức hợp II (từ succinate), đi qua Phức hợp III đến cytochrome c, rồi qua Phức hợp IV đến oxy. Gradient được tạo ra trên đường đi là nguồn năng lượng mà tế bào sử dụng để tạo ATP.

Nhận định về khả năng đi vòng có nghĩa là xanh methylen nhận electron ở phía trước điểm chặn và chuyển chúng đến phía sau điểm chặn. Chất màu ở dạng oxy hóa nhận electron từ NADH hoặc các thành phần đầu chuỗi, trở thành leucomethylene blue, rồi dạng khử chuyển electron cho cytochrome c hoặc đưa chúng trở lại chuỗi. Nếu điểm chuyển giao nằm phía sau điểm chặn, hô hấp và điện thế màng phục hồi một phần. Nếu điểm chuyển giao nằm ngay tại hoặc phía trước điểm chặn, không có sự phục hồi.

Một chi tiết của Phức hợp III quyết định phần lớn cuộc tranh luận này. Phức hợp vận hành chu trình Q với hai vị trí gắn chất ức chế. Antimycin gắn vào vị trí Qi. Myxothiazol gắn vào vị trí Qo. Nghiên cứu chỉ dùng một trong hai chất mới kiểm tra được một nửa phức hợp.

Nghiên cứu thứ nhất: không có đường đi vòng trong ty thể não chuột nhắt

Gureev và cộng sự sử dụng ty thể vỏ não của chuột nhắt C57BL/6, phân lập bằng digitonin, với nồng độ protein 0.1 mg per ml khi đo. Cơ chất gồm ba điều kiện: pyruvate kết hợp malate, mỗi chất ở 5 mM; succinate ở 10 mM kết hợp glutamate ở 2 mM; và L-proline ở 10 mM. Các chất chặn là rotenone ở 1 micromolar (Phức hợp I) và antimycin ở 1 microgram per ml (Phức hợp III). Liều chất màu là 0.5, 1 và 2 micromolar, trong đó 1 micromolar là nồng độ chính. Phương pháp và các đường ghi tín hiệu nằm trong bài báo ngắn trên FEBS Letters.

Đường đi vòng qua Phức hợp I hoạt động. Rotenone làm giảm hô hấp được ADP kích thích từ khoảng 121 xuống khoảng 2 nmol per minute per mg, và chất màu ở 1 micromolar khôi phục mức này lên khoảng 21. Điện thế màng phục hồi khi dùng pyruvate kết hợp malate và khi dùng L-proline.

Đường đi vòng qua Phức hợp III không hoạt động. Antimycin làm giảm hô hấp xuống khoảng 16, và chất màu chỉ nâng mức này lên khoảng 20. Điện thế màng không phục hồi với bất kỳ cơ chất nào, ở liều chất màu lên đến 5 micromolar. Dữ liệu peroxide cũng chỉ theo cùng một hướng: riêng chất màu làm tăng tốc độ phát thải peroxide từ mức nền gần 76 pmol per minute per mg lên khoảng 1170, 1460 và 1945 ở ba liều, nhưng antimycin làm giảm tín hiệu do chất màu tạo ra này lần lượt khoảng 25, 88 và 96 phần trăm. Nếu chất màu dạng khử phản ứng trực tiếp với oxy, việc chặn Phức hợp III lẽ ra không làm giảm tín hiệu. Các tác giả suy luận rằng chất màu dạng khử bị oxy hóa tại vị trí Qo của Phức hợp III, nằm phía trước điểm chặn của antimycin. Diễn đạt vòng ngắn này bằng lời: chất cho electron chuyển cho chất màu, chất màu chuyển đến Qo, rồi tiếp tục theo đường bình thường. Rotenone được đi vòng qua. Antimycin thì không.

Nghiên cứu thứ hai: đi vòng một phần ở ba loài, tại cả hai vị trí gắn chất ức chế

Svab và cộng sự mở rộng thiết kế thí nghiệm. Ty thể não của chuột nhắt, chuột cống và chuột lang được phân lập bằng Percoll, đo ở cùng nồng độ 0.1 mg per ml, với pyruvate kết hợp malate hoặc glutamate kết hợp malate, mỗi chất ở 5 mM. Họ dùng hai chất chặn Phức hợp III: antimycin A ở 0.3 micromolar và myxothiazol ở 1 micromolar. Chất màu ở 2 micromolar trong phần lớn phép đo, và 0.5 trong các thí nghiệm với cytochrome c. Dữ liệu của cả ba loài với quy trình tương ứng nằm trong bài báo truy cập mở.

Cả hai điểm chặn đều được đi vòng qua một phần, ở cả ba loài. Trong ty thể chuột nhắt, antimycin ức chế hô hấp và chất màu làm tăng hô hấp khoảng 60 phần trăm, từ khoảng 37 lên 59 nmol per minute per mg. Myxothiazol ức chế hô hấp 88 phần trăm, xuống khoảng 4.5, và chất màu làm tăng gấp năm lần lên khoảng 23. Điện thế màng tái phân cực một phần dưới tác động của từng chất ức chế, được đo bằng hai chất màu (safranin O và TMRM theo tỷ số) để loại trừ nhiễu quang học.

Bài báo này cũng kiểm tra trực tiếp sự chuyển giao electron, điều mà nghiên cứu thứ nhất chưa từng làm. Cytochrome c acetyl hóa ngoại sinh ở 25 micromolar không bị khử bởi ty thể đang được cấp năng lượng, dù có hay không có chất ức chế, nhưng việc thêm chất màu thúc đẩy quá trình khử trong cả hai trường hợp. Trong dung dịch đệm không có tế bào, NADH kết hợp chất màu khử cytochrome c với tốc độ tỷ lệ thuận với NADH. Diễn đạt bước nhảy dài hơn này bằng lời: các đương lượng khử chuyển cho chất màu, chất màu chuyển trực tiếp cho cytochrome c, rồi Phức hợp IV chuyển đến oxy. Tuyến này bỏ qua hoàn toàn Phức hợp III, nên có thể đi vòng qua cả hai chất chặn.

Hai chỉ số đo bổ sung củng cố cách diễn giải đó. Huỳnh quang NAD(P)H giảm khi thêm chất màu vào ty thể được xử lý bằng myxothiazol, cho thấy các đương lượng khử được tiêu thụ qua tuyến mới. Đồng thời, độ hấp thụ của chất màu tại 660 nm theo dõi lần lượt từng lần bổ sung, còn dịch nổi sau ly tâm cho thấy chất màu dạng oxy hóa tích tụ bên trong ty thể đang được cấp năng lượng với mức tăng hơn một trăm lần, rồi thoát ra khi điện thế sụp đổ. Cân đối proton cũng phù hợp: bỏ qua các bước bơm chỉ còn khoảng 2 proton trên mỗi cặp electron thay vì 10, nên việc sử dụng oxy nhanh hơn nhưng chỉ tái phân cực một phần là biểu hiện của một đường đi vòng thực sự, không phải bằng chứng phủ nhận nó.

Cũng chính mẫu ty thể này tạo ra những đáp ứng dễ khiến người đọc hời hợt hiểu sai. Khi có chất ức chế cùng chất màu, ADP làm giảm hô hấp thay vì tăng, và việc chặn vận chuyển lại kích thích hô hấp thay vì làm chậm, trong khi điện thế màng vẫn thay đổi theo các hướng bình thường. Chỉ xét mức tiêu thụ oxy sẽ dẫn đến hiểu sai trong hệ này.

Nghiên cứu thứ ba: nghiên cứu trên gan kiểm tra Phức hợp I và II, không phải III

Lee và Boelsterli sử dụng ty thể gan chuột nhắt và tế bào gan nuôi cấy bị tổn thương bởi efavirenz (Phức hợp I, IC50 gần 30 micromolar) và hydrazine, chất chuyển hóa của isoniazid (Phức hợp II, IC50 gần 30 micromolar). Chất màu ở khoảng 30 micromolar khôi phục quá trình oxy hóa NADH, điện thế màng và ATP, đồng thời làm giảm các chất oxy hóa và sự chết tế bào do hoại tử. Bài báo trên Redox Biology mô hình hóa hiện tượng này thành việc chất màu mang electron đi vòng qua các Phức hợp I và II bị tổn thương.

Kết quả đó là cơ sở đã được thống nhất về phần phía trước của chuỗi, và không nói lên điều gì về Phức hợp III vì không có thành phần nào ở đó bị chặn. Nó không thể xác nhận hay bác bỏ bất kỳ nghiên cứu nào trong hai nghiên cứu trên não.

Bảng đối chiếu điều kiện

Bốn lý do khiến cả hai nghiên cứu về Phức hợp III có thể đúng trong điều kiện riêng của mình

1. Chất chặn không phải cùng một can thiệp. Một bên chỉ dùng antimycin ở 1 microgram per ml, bên kia dùng antimycin ở 0.3 micromolar cùng một chất chặn riêng tại vị trí Qo. Tuyến chất màu đưa electron vào vị trí Qo thất bại đúng ở nơi tuyến đi trực tiếp đến cytochrome c thành công. Một vị trí không thể đại diện cho cả hai.

2. Liều chất màu và thời điểm khác nhau. Nồng độ chính là 1 so với 2 micromolar, với một chất tham gia chu trình oxy hóa–khử mà sự thu nhận và khả năng khử trực tiếp cytochrome c phụ thuộc vào nồng độ và thời gian. Chênh lệch liều nhỏ cộng với thời điểm đo khác nhau có thể làm lộ ra những nhánh khác nhau của cùng một mạng lưới.

3. Mẫu chuẩn bị khác nhau. Phân lập bằng digitonin so với phân lập bằng gradient Percoll chọn ra các quần thể ty thể có phần trùng nhau nhưng không hoàn toàn giống nhau. Nồng độ protein đều là 0.1 mg per ml, nên có thể loại biến số đó, nhưng không thể loại khác biệt về các quần thể con và tính toàn vẹn. Và nghi vấn về loài đã được loại trừ: nhóm thứ hai cũng tái hiện kiểu đáp ứng của mình ở chuột nhắt.

4. Trạng thái cơ chất quyết định chất màu có thể làm gì. Ba điều kiện cơ chất so với các cặp liên kết với NADH. Nguồn cung NADH và điện thế màng cùng quyết định tốc độ khử chất màu và sự phân bố của nó; một tuyến cần chất màu dạng khử nằm cạnh cytochrome c dạng oxy hóa sẽ bị chi phối bởi lựa chọn đó.

Cách đọc nhận định tiếp theo về đường đi vòng

Hãy hỏi phức hợp nào đã bị chặn, bằng chất ức chế nào, ở vị trí nào và liều bao nhiêu. Hãy hỏi nồng độ chất màu và thời điểm đo. Hãy hỏi về mô, loài, cách phân lập, nồng độ protein và cơ chất. Và hãy hỏi liệu điện thế, hô hấp, trạng thái oxy hóa–khử và phép thử chuyển giao trực tiếp có nhất quán với nhau hay không, vì chỉ riêng mức tiêu thụ oxy đã hơn một lần chỉ sai hướng trong các nghiên cứu này.

Kết luận trong phạm vi hẹp vẫn đứng vững. Khả năng chất màu đi vòng qua Phức hợp I đã được thống nhất. Với Phức hợp III, ty thể chuột nhắt dùng antimycin ở 1 microgram per ml và chất màu ở 1 micromolar không cho thấy đường đi vòng có tác dụng chức năng, trong khi ba loài dùng antimycin ở 0.3 micromolar hoặc myxothiazol ở 1 micromolar và chất màu ở 2 micromolar cho thấy đường đi vòng một phần với sự chuyển giao trực tiếp từ chất màu đến cytochrome c. Những kết luận đó có thể cùng tồn tại. Mọi nhận định rộng hơn đều là ngoại suy.

Các bài đọc liên quan giúp đặt nhận định còn tranh luận trong nền tảng hóa học đã được thống nhất: cách xanh methylen chuyển electron giải thích cơ chế chuyển tiếp, các thí nghiệm đi vòng qua Phức hợp I trình bày trường hợp đã được thống nhất ở phía trước chuỗi, các phép đo điện thế màng và nhiễu của chúng giải thích vì sao cần hai chất màu, và cách thao tác với các chất tham gia chu trình oxy hóa–khử trong phòng thí nghiệm giúp nhận diện những bẫy về liều và thời điểm.