Vì sao độ hấp thụ của xanh methylen thay đổi theo nồng độ

Lấy một chai dung dịch gốc xanh methylen và rót ra hai cốc. Rót dung dịch gốc vào cốc thứ nhất và dung dịch đã pha loãng mười lần vào cốc thứ hai. Cốc thứ hai có màu nhạt hơn, đúng như dự đoán. Nhưng nhìn kỹ sẽ thấy một điều khác cũng đã thay đổi: sắc màu đã dịch chuyển. Một dung dịch thiên về màu xanh da trời trong trẻo, còn dung dịch kia thiên về màu xanh pha tím. Pha loãng không chỉ làm giảm cường độ màu. Nó còn thay đổi dạng hóa học đóng góp phần lớn vào sự hấp thụ.

Nguyên lý đằng sau sự dịch chuyển này rất đơn giản. Xanh methylen hòa tan không chỉ tồn tại dưới một dạng. Cation chất màu đơn lẻ, gọi là monomer, có thể xếp chồng mặt đối mặt với một cation thứ hai để tạo thành dimer, rồi các dimer có thể phát triển thành những tập hợp lớn hơn. Mỗi dạng có phổ hấp thụ riêng. Kết quả máy đo quang phổ ghi nhận là tổng đóng góp của hỗn hợp hiện diện trong cuvet, dưới những điều kiện cụ thể đó. Thay đổi thành phần hỗn hợp sẽ làm phổ thay đổi, ngay cả khi tổng lượng chất màu vẫn tuân theo đúng tỷ lệ pha loãng.

Monomer và dimer hấp thụ khác nhau

Hãy hình dung monomer như một tấm thẻ phẳng với điện tích dương phân bố trên hệ vòng. Hai tấm thẻ như vậy có thể áp mặt vào nhau. Các điện tích dương đẩy nhau, nhưng các bề mặt vòng thơm phẳng hút nhau thông qua tương tác xếp chồng, còn nước và ion đối xung quanh che chắn lực đẩy. Kết quả là một cặp liên kết có các trạng thái điện tử chung. Các chuyển mức được phép của cặp này có năng lượng cao hơn chuyển mức của monomer, nên dải hấp thụ của dimer xuất hiện ở bước sóng ngắn hơn dải của monomer; các tập hợp lớn hơn đóng góp thêm một vai phổ về phía bước sóng ngắn.

Ở nồng độ rất thấp trong nước sạch, monomer chiếm ưu thế và dải bước sóng dài cũng chiếm ưu thế. Khi tổng nồng độ tăng, dạng ghép cặp chiếm tỷ phần ngày càng lớn, và dải bước sóng ngắn tăng lên tương đối so với dải thứ nhất. Vì vậy, tỷ số giữa hai dải phản ánh thành phần hỗn hợp, chứ không trực tiếp phản ánh tổng nồng độ. Phép đo tại một bước sóng duy nhất không thể phân biệt hai dạng nếu không có giả định về dạng nào đang hiện diện.

Đó là lý do phổ tham chiếu luôn phải đi kèm điều kiện đo. Tài liệu tham chiếu phổ của xanh methylen liệt kê vị trí các dải cùng với dung môi, nền muối, pH, nhiệt độ và khoảng nồng độ đã tạo ra chúng. Nếu trích dẫn một đỉnh phổ mà không nêu các điều kiện đó, con số sẽ thiếu thông tin. Hai phòng thí nghiệm có thể đều đúng khi ghi nhận các phổ khác nhau từ cùng một chất màu, vì họ đã đo những hỗn hợp khác nhau.

Những yếu tố làm dịch chuyển cân bằng

Nồng độ là yếu tố chi phối chính. Sự hình thành dimer cần hai monomer gặp nhau, nên tỷ phần dimer tăng nhanh hơn tuyến tính theo tổng lượng chất màu. Các hằng số tạo dimer trong nước được báo cáo có giá trị ở mức hàng nghìn trên molar gần nhiệt độ phòng, nên tỷ phần dimer tăng mạnh trong khoảng micromolar. Một phép khớp toàn cục trên phạm vi rộng, từ micromolar đến millimolar, đã phát hiện đóng góp khác không của tetramer ngay ở mức dưới 34 micromolar. Điều này cảnh báo không nên tin tuyệt đối vào mô hình chỉ gồm hai dạng ở mức hàng chục micromolar. Tỷ phần chính xác phụ thuộc vào môi trường, nên bài viết này trình bày chiều hướng thay đổi thay vì một bảng quy đổi áp dụng phổ quát.

Muối là yếu tố chi phối thứ hai. Các ion hòa tan che chắn lực đẩy giữa hai cation, nên việc thêm natri clorua và các chất điện ly tương tự đẩy hỗn hợp về phía dimer và các tập hợp ở cùng nồng độ chất màu. Hiệu ứng này được thể hiện trong các nghiên cứu về sự kết tập của xanh methylen trong môi trường nước muối và nước, trong đó chất màu ở nồng độ khoảng 1 micromolar đến 3.4 millimolar được đo với nồng độ natri clorua từ 0 đến 0.15 molar. Trong phép khớp đó, tỷ phần tetramer đạt khoảng 0.93 ở vùng có cả nồng độ chất màu và muối cao. Vì vậy, phổ ghi trong nước và phổ ghi trong nước muối sinh lý không thể dùng làm chuẩn thay thế cho nhau.

Nhiệt độ tác động theo chiều ngược lại. Sự xếp chồng giải phóng nước liên kết và bị chuyển động nhiệt cản trở, nên làm ấm dung dịch thường khiến một phần dimer phân ly trở lại thành monomer, còn làm lạnh thúc đẩy sự kết hợp. Enthalpy phân ly thu được từ phép khớp mang giá trị âm, khoảng âm 30 kilojoules per mole trong khoảng 282 đến 333 kelvin, xác nhận sự kết hợp là quá trình tỏa nhiệt. Một mẫu lạnh được đo ngay sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh có thể biểu hiện mức kết tập cao hơn so với chính mẫu đó sau khi cân bằng về nhiệt độ phòng.

Dung môi quyết định trạng thái nền. Nước, với hiệu ứng kỵ nước mạnh, thúc đẩy các cation chất màu phẳng xếp chồng lên nhau. Các alcohol như ethanol và methanol solvat hóa các vòng tốt hơn và phá vỡ các tập hợp, nên ở cùng nồng độ chất màu, dung dịch trong ethanol thể hiện đặc tính monomer rõ hơn dung dịch trong nước. Các đồng dung môi không cho proton cũng có tác dụng tương tự: trong hỗn hợp nước và DMSO ở 293 kelvin, việc thêm DMSO ức chế sự tạo dimer, cho thấy cấu trúc của nước là một động lực thúc đẩy xếp chồng. Cần thận trọng với chất hoạt động bề mặt vì chúng có thể tác động theo cả hai chiều. Trên nồng độ micelle tới hạn, các micelle có thể hòa tan từng monomer riêng lẻ và khôi phục phổ giống monomer. Dưới ngưỡng đó, chất hoạt động bề mặt mang điện tích trái dấu lại có thể thúc đẩy sự xếp chồng: ở nồng độ chất màu 100 micromolar, sự tạo chuỗi do SDS thúc đẩy đạt cực đại gần 4 millimolar SDS, khoảng một nửa ngưỡng tạo micelle, trước khi xảy ra sự tái phân bố ở nồng độ chất hoạt động bề mặt cao hơn. Nghiên cứu về ảnh hưởng của tương tác chất màu–dung môi và môi trường có tổ chức đến phổ xanh methylen cho thấy môi trường phân tử ngay xung quanh, chứ không chỉ nồng độ tổng thể, quyết định mạnh mẽ các dải phổ quan sát được.

pH chủ yếu có ảnh hưởng ở các vùng cực trị. Trong khoảng gần trung tính được dùng ở phần lớn công việc phòng thí nghiệm, xanh methylen vẫn giữ dạng cation màu xanh quen thuộc, và sự kết tập là yếu tố chủ đạo chi phối phổ. Acid hoặc base mạnh, phản ứng oxy hóa–khử tạo dạng leuco không màu, hoặc sự liên kết với protein và các hạt đều bổ sung những trạng thái ngoài cặp monomer-dimer. Khi phổ thay đổi sau khi thêm dung dịch đệm, hãy kiểm tra thành phần muối và các thành phần có khả năng liên kết trong dung dịch đệm trước khi quy mọi thay đổi cho riêng pH. Tài liệu tham chiếu về hóa học và sự proton hóa tách riêng các câu hỏi về dạng hóa học này khỏi vấn đề kết tập được bàn ở đây.

Vì sao đường thẳng Beer-Lambert bị uốn cong

Hệ thức Beer-Lambert phát biểu rằng độ hấp thụ bằng hệ số hấp thụ nhân với nồng độ và chiều dài đường quang. Đây là một định luật dựa trên việc đếm. Nó giả định rằng các đối tượng được đếm vẫn giữ nguyên bản chất khi số lượng thay đổi: chỉ một dạng hấp thụ, phổ cố định, không có biến đổi hóa học theo nồng độ, ánh sáng thăm dò đơn sắc, không có tán xạ hay tái phát xạ, và ánh sáng thực sự đi qua chiều dài đường quang đã nêu.

Sự kết tập phá vỡ giả định đầu tiên. Về mặt toán học, tổng độ hấp thụ vẫn là tổng đóng góp của các dạng: chiều dài đường quang nhân với hệ số hấp thụ của từng dạng và nồng độ riêng của dạng đó. Mỗi dạng đều tuân theo định luật. Hỗn hợp thì không, vì nồng độ của từng dạng là hàm phi tuyến của tổng lượng chất màu. Do đó, đường chuẩn biểu diễn độ hấp thụ tại dải monomer theo tổng lượng chất màu ban đầu là đường thẳng ở giới hạn pha loãng, rồi cong xuống khi nồng độ tăng, vì mỗi phần chất màu thêm vào mang theo tỷ lệ monomer thấp hơn. Đường cong đo tại dải dimer uốn theo chiều ngược lại. Các nghiên cứu về kết tập chỉ rõ chính cơ chế này là nguồn gốc của những sai lệch Lambert-Beer quan sát được. Khớp một đường thẳng qua vùng cong rồi ngoại suy là sai lầm thường gặp. Đường thẳng chỉ có giá trị trong khoảng đo và nền mẫu đã dùng để xây dựng nó.

Pha loãng tạo ra một cạm bẫy liên quan. Pha loãng dung dịch gốc đậm đặc để đưa vào khoảng đo của thiết bị không giữ nguyên tỷ lệ giữa các dạng. Dung dịch đã pha loãng trong cuvet tái cân bằng theo hướng tăng monomer, nên phổ của nó mô tả đúng mẫu pha loãng nhưng không mô tả đúng dung dịch gốc. Tính ngược phổ của dung dịch gốc bằng cách nhân tăng độ hấp thụ chỉ khôi phục được ước tính tổng hàm lượng nếu phép hiệu chuẩn đã tính đến sự dịch chuyển này. Cách đó không bao giờ khôi phục được hình dạng dải ban đầu. Bất kỳ ai so sánh phổ của dung dịch đậm đặc với phổ tham chiếu loãng đều đang so sánh hai hỗn hợp khác nhau.

Chiều dài đường quang là một phần của kết quả

Độ hấp thụ tỷ lệ với quãng đường ánh sáng đi qua mẫu. Một cuvet 10 mm cho độ hấp thụ gấp mười lần cuvet 1 mm chứa cùng dung dịch. Sự tỷ lệ này chỉ chính xác khi dung dịch không đổi, và sự kết tập khiến điều kiện đó trở nên thiết yếu.

Trong thực hành, chiều dài đường quang là công cụ để giữ phép đo trong khoảng hợp lệ. Đường quang dài mang lại độ nhạy cho các dung dịch loãng, chủ yếu ở dạng monomer. Đường quang ngắn giữ mẫu đậm đặc trong thang đo mà không cần bước pha loãng lớn làm thiết lập lại cân bằng. Chương trình nghiên cứu kết tập cung cấp các số liệu ở trên đã áp dụng đúng cách này: buồng đo 1 centimeter cho chất màu ở nồng độ 1.1 đến 34 micromolar, và buồng đo 0.01 centimeter cho nồng độ 94 micromolar đến 3.4 millimolar. Các bệ đo thể tích siêu nhỏ và máy đọc đĩa có hình học riêng, với đường quang ngắn, đôi khi thay đổi, cùng các bề mặt mà chất màu cation có thể bị hấp phụ lên. Hãy báo cáo chiều dài đường quang cùng với số đo, giống như tài liệu tham chiếu phổ báo cáo dung môi và muối. Độ hấp thụ không đi kèm chiều dài đường quang không phải là một kết quả. Nó chỉ là lời truyền miệng.

Kỷ luật đo lường được rút ra từ cơ chế này. Đưa các mẫu về cùng một nhiệt độ trước khi đo. Dùng cùng loại cuvet và cùng hướng đặt, các mẫu trắng tương ứng chứa cùng nền muối và dung dịch đệm, cùng dụng cụ thủy tinh sạch, vì xanh methylen hấp phụ lên thủy tinh và nhựa, còn một cuvet bị nhuộm màu lưu dấu mẫu đậm đặc đã đo trước đó. Đo ngay sau khi chuẩn bị nếu động học kết tập có ý nghĩa, và xây dựng mỗi đường chuẩn trong cùng nền mẫu, với cùng chiều dài đường quang như các mẫu chưa biết. Khi kiểm tra bằng mắt, hãy nhớ rằng mắt không phải là máy đo quang phổ tốt. Liệu màu dung dịch có thể xác định độ tinh khiết hay không là một câu hỏi riêng với câu trả lời là không, và sự thay đổi sắc màu do kết tập là một trong những lý do.

Một sơ đồ để đặt cạnh thiết bị

Hình dưới đây cô đọng bài viết thành một tài liệu tham khảo tại bàn thí nghiệm. Ba dung dịch chứa cùng chất màu nhưng khác nhau về tổng nồng độ và nền muối. Các phổ minh họa cho thấy dải monomer ở bước sóng dài mất dần tỷ phần vào dải dimer ở bước sóng ngắn hơn khi mức xếp chồng tăng. Các điều kiện được ghi ngay trên hình vì không có chúng thì không thể dùng lại các đường cong. Để tra vị trí dải đo được dưới những điều kiện đã nêu, hãy dùng tài liệu tham chiếu phổ. Về cách chất màu đi vào tế bào sau khi đã hòa tan, xem sự đi vào tế bào thông qua quá trình khử và phân bố. Về cách liều ánh sáng và hình học tiếp tục định hình kết quả đo quang hóa, xem phơi sáng và hình học đo lường.

Nguyên tắc cần ghi nhớ có hai phần. Phổ xác định hỗn hợp hiện diện trong cuvet dưới các điều kiện đã nêu. Chỉ phép hiệu chuẩn được xây dựng dưới chính những điều kiện đó mới chuyển đổi độ hấp thụ thành tổng nồng độ.