Các lựa chọn thay thế xanh methylene cho kính hiển vi: chọn theo mục đích

Đối với một phết vi khuẩn đơn giản, tím tinh thể có thể thay thế xanh methylene khi mục tiêu là quan sát hình dạng tế bào. Đối với tế bào sống, phương án tốt hơn có thể là kính hiển vi tương phản pha mà không cần nhuộm. Lựa chọn phụ thuộc vào quan sát mà bạn cần thực hiện.

Giả sử hai người đang kiểm tra cùng một mẫu nuôi cấy vi khuẩn. Một người muốn phân biệt tế bào hình que với tế bào hình tròn. Người kia muốn biết liệu một biện pháp xử lý có tiêu diệt vi khuẩn hay không. Một phương pháp nhuộm cho người thứ nhất hình ảnh rõ ràng có thể không cung cấp câu trả lời hữu ích nào cho người thứ hai.

Trước khi chọn chất thay thế, hãy hoàn thành câu sau: “Tôi cần quan sát ___ trong ___, và các tế bào phải / không cần duy trì trạng thái sống.” Câu này xác định nhiệm vụ mà phương pháp nhuộm phải thực hiện.

Bắt đầu từ mẫu vật và câu hỏi

Trước tiên, hãy xác định liệu tế bào có phải duy trì trạng thái sống hay không, sau đó xác định đặc điểm bạn cần quan sát:

• Tế bào phải duy trì trạng thái sống: để quan sát chuyển động hoặc hình dạng, hãy cân nhắc tương phản pha không nhuộm hoặc DIC; đối với DNA nhân, hãy cân nhắc Hoechst 33342 với huỳnh quang; đối với tính toàn vẹn của màng, hãy chọn một phép thử đã được xác nhận như SYTO 9 kết hợp với propidium iodide.
• Tế bào không cần duy trì trạng thái sống: đối với hình thái vi khuẩn, hãy cân nhắc nhuộm đơn bằng tím tinh thể hoặc nhuộm âm bản bằng nigrosin; đối với phản ứng Gram, hãy sử dụng đầy đủ phương pháp nhuộm Gram; đối với DNA nhân trong tế bào đã cố định, hãy cân nhắc huỳnh quang DAPI.

Sử dụng bảng này để so sánh các hạn chế của từng nhánh. Đây là các lựa chọn phương pháp, không phải hướng dẫn đổi chai thuốc thử trong một quy trình hiện có.

Với phết đơn giản, hãy thay thế phương pháp một cách thận trọng

Tím tinh thể là một lựa chọn thực tế khi nhiệm vụ là quan sát hình thái vi khuẩn bằng một màu duy nhất. Bacteriological Analytical Manual của FDA liệt kê hai công thức tím tinh thể phù hợp cho nhuộm đơn giản. Hãy sử dụng công thức đã được ghi chép và phương pháp pha chế tương ứng; chỉ tên của thuốc nhuộm không đủ để xác định một thuốc thử làm việc.

Tím tinh thể cũng được sử dụng trong nhuộm Gram, nhưng điều đó không biến nhuộm đơn bằng tím tinh thể thành nhuộm Gram. Trong quy trình nhuộm Gram của ASM, kết quả phân biệt phụ thuộc vào tím tinh thể, iodine, tẩy màu và nhuộm đối màu hoạt động theo trình tự. Bỏ qua những bước đó sẽ làm thay đổi những gì hình ảnh có thể chứng minh. Xem nhuộm đơn giản so với nhuộm Gram để hiểu sự khác biệt này.

Nigrosin cung cấp một cách khác để làm rõ đường viền: nó làm tối nền trong khi các tế bào vi khuẩn vẫn tương đối sáng. Có một chi tiết hữu ích trong hướng dẫn sử dụng nigrosin của Merck mà danh sách chất thay thế chung có thể bỏ sót. Công thức làm việc được chỉ định của sản phẩm có chứa formaldehyde. Vì vậy, bạn không thể suy ra khả năng tương thích với tế bào sống chỉ từ cụm từ “nhuộm âm bản”, dù bản thân các tế bào có vẻ không bắt màu. Hãy kiểm tra toàn bộ công thức và cách chuẩn bị mẫu vật.

Với mẫu vật sống, hãy cân nhắc thay đổi hệ quang học

Nếu bạn muốn theo dõi tế bào di chuyển hoặc phân chia, việc thêm một thuốc nhuộm khác có thể làm phức tạp quan sát. Như Nikon giải thích trong hướng dẫn về độ tương phản ở mẫu vật trong suốt, tương phản pha và tương phản giao thoa vi sai, hay DIC, làm cho mẫu vật trở nên nhìn thấy được thông qua sự khác biệt về các đặc tính quang học. Các phương pháp này có thể làm rõ tế bào sống không nhuộm, với điều kiện kính hiển vi có các thành phần cần thiết.

Lựa chọn này giữ cho mẫu chuẩn bị không bị nhuộm, nhưng làm thay đổi loại thông tin có thể thu được. Bạn có thể theo dõi một ranh giới hoặc một chuyển động mà không biết phân tử nào tạo ra độ tương phản. Nếu câu hỏi liên quan đến vị trí của phân tử, hãy chọn một phương pháp đánh dấu phù hợp.

Đối với DNA nhân, so sánh thuốc nhuộm DAPI và Hoechst của Invitrogen phân biệt việc DAPI thường được sử dụng với tế bào đã cố định với Hoechst 33342 có khả năng thấm vào tế bào cao hơn và được ưu tiên để đánh dấu tế bào sống. Cả hai đều cần thiết bị huỳnh quang. Không loại nào là chất thay thế trực tiếp cho thuốc nhuộm màu dùng trong kính hiển vi trường sáng.

Hãy coi việc tiếp xúc với thuốc nhuộm và chiếu sáng là các điều kiện thí nghiệm. So sánh mẫu nhuộm và không nhuộm khi hành vi của tế bào là đại lượng bạn đang đo.

Một tế bào màu đỏ không tự động đồng nghĩa với tế bào chết

SYTO 9 và propidium iodide thường được sử dụng cùng nhau để đánh giá tính toàn vẹn của màng vi khuẩn. Hướng dẫn BacLight liên hệ màng còn nguyên vẹn với nhuộm màu xanh lục và màng bị tổn thương với nhuộm màu đỏ. Cách diễn giải đó cần được xác nhận đối với mẫu vật cụ thể.

Một nghiên cứu năm 2019 của Rosenberg và các cộng sự minh họa vấn đề này. Trong màng sinh học E. coli 24-hour trên kính trong dung dịch đệm phosphate, khoảng 96% tế bào có vẻ dương tính với propidium iodide tại chỗ. Tuy nhiên, các tác giả ước tính rằng 82% vẫn có thể nuôi cấy được sau khi thu mẫu. Hình ảnh hiển vi đồng tiêu cho thấy các tế bào có phần bên trong màu xanh lục nằm dưới vật liệu nhuộm đỏ, cho thấy acid nucleic ngoại bào góp phần tạo ra tín hiệu gây hiểu nhầm.

Các tỷ lệ phần trăm đó mô tả những phép đo khác nhau trên các mẫu chuẩn bị của nghiên cứu, không phải một hệ số hiệu chỉnh phổ quát. Bài học hữu ích là phải kiểm tra yếu tố nào đã tạo ra tín hiệu. Trong màng sinh học, thuốc nhuộm acid nucleic có thể phát hiện vật liệu bên ngoài tế bào cũng như bên trong các tế bào bị tổn thương. Để đưa ra kết luận về khả năng sống, các nhà nghiên cứu khuyến nghị sử dụng các phép đo bổ sung, chẳng hạn như nuôi cấy hoặc hoạt tính chuyển hóa, đồng thời thừa nhận rằng mỗi phương pháp đều có hạn chế.

Kiểm tra phương án thay thế thực sự chứa những gì

Một phương pháp nhuộm thay thế vẫn có thể chứa xanh methylene. Giemsa là một ví dụ: Merck mô tả sản phẩm của mình là một dung dịch azure-eosin-methylene-blue, dành cho các ứng dụng bao gồm phết máu và tủy xương. Đây có thể là một phương pháp khác cho một loại mẫu vật khác, nhưng không đáp ứng yêu cầu loại trừ xanh methylene.

Nếu việc loại trừ một hợp chất là một phần của thí nghiệm, hãy kiểm tra danh tính và công thức thuốc thử trước khi so sánh hình ảnh. Hướng dẫn về methyl blue, methylene blue và các thuốc nhuộm có tên tương tự giải thích sự khác biệt về tên gọi.

Xác minh việc thay thế trước khi sử dụng kết quả

Đối với một phương pháp mới, hãy thực hiện một phép so sánh quy mô nhỏ bằng các mẫu vật đại diện và mẫu đối chứng phù hợp. Giữ các thiết lập kính hiển vi tương đương khi có thể. Ghi lại công thức thuốc thử, cách chuẩn bị mẫu vật, mức phơi nhiễm và điều kiện chụp ảnh để có thể điều tra nguyên nhân của một hình ảnh trông tốt hơn thay vì chỉ đơn thuần ưu tiên hình ảnh đó.

Đánh giá mức độ thành công dựa trên câu hỏi ban đầu. Đối với hình thái, hãy đánh giá xem ranh giới và cách sắp xếp của tế bào có còn diễn giải được hay không. Đối với đánh dấu nhân, hãy đánh giá vị trí tín hiệu và nền. Đối với khả năng sống, cần có bằng chứng vượt ra ngoài sự phân tách màu sắc bắt mắt. Hướng dẫn tổng quát hơn về nhuộm xanh methylene và các ứng dụng trong phòng thí nghiệm giải thích mối liên hệ giữa quan sát và cách chuẩn bị mẫu.

Hãy chọn phương án thay thế duy trì được phép đo bạn cần. Màu sắc chỉ là một thuộc tính của hình ảnh thu được.