Metilen ko‘kini hujayra nafas olishi bilan bog‘lagan tajribalar

Fibrindan tozalangan odam qoni 37 °C da uch soat saqlanganda, tarkibidagi kislorodning taxminan ikki foizini iste’mol qiladi. Inkubatsiyadan oldin oz miqdorda metilen ko‘ki qo‘shilsa, ayni qon kislorodning taxminan oltmish besh foizini iste’mol qiladi. Hujayralarning o‘zida hech narsa o‘zgarmagan. Faqat eritma o‘zgargan.

Bu raqam Johns Hopkins universitetida George Harrop va E. S. Guzman Barron tomonidan 1928-yilda chop etilgan maqoladan olingan. Metilen ko‘ki hujayra nafas olishini yaxshilaydi, degan ko‘p takrorlanadigan fikr ham shundan kelib chiqqan. Bu fikr noto‘g‘ri emas, ammo uning ma’nosi eshitilganidan torroq.

Jadvaldagi raqam aslida nimani o‘lchaydi

Yakuniy ko‘rsatkich gaz tahlili orqali aniqlangan kislorod yutilishi edi. Harrop va Barron yangi olingan qonni oq qon hujayralaridan tozalash uchun 10 °C da paxta orqali filtrlashgan, namunani kislorod bilan to‘yintirib, qismlarga ajratishgan, bir qismiga bo‘yoq qo‘shishgan va inkubatsiyadan so‘ng ikkalasini ham tahlil qilishgan. Leykotsitlar soni har kub millimetrda taxminan mingdan kamdan-kam oshgan. Kislorod sarfi namunadagi boshlang‘ich kislorod miqdorining yo‘qolgan ulushi sifatida berilgan.

Ular karbonat angidridni ham o‘lchashgan, ammo bu borada usul qiyinchilik tug‘dirgan. Fibrindan tozalangan qon inkubatsiyaning birinchi soatida o‘rganilayotgan reaksiyaga aloqador bo‘lmagan sabablarga ko‘ra har 100 mL uchun ikki millimolgacha karbonat angidrid ajratgan. Shu sababli to‘liq qondan olingan nafas koeffitsiyentlarini ishlatib bo‘lmagan. Faqat Locke eritmasidagi yuvilgan hujayralar talqin qilish mumkin bo‘lgan ko‘rsatkichlarni bergan; bo‘yoq borligida ham, yo‘qligida ham ular 0.73 va 0.80 oralig‘ida bo‘lgan.

Bu arzimas tafsilot emas. Ushbu maqolalarda “nafas olish” yopiq idishdagi gaz almashinuvini anglatadi. Kislorod sarfi bilan foydali energiya hosil bo‘lishi o‘rtasidagi tafovut kislorod sarfi ATP haqida nimani bildirishi va nimani bildirmasligi haqidagi maqolada alohida ko‘rib chiqilgan.

Bo‘yoq eng kam nafas oladigan hujayralarga eng ko‘p ta’sir qilgan

Sutemizuvchilarning yetilgan eritrotsitlarida o‘lchash mumkin bo‘lgan kislorod sarfi deyarli yo‘q. Qushlarning yadroli eritrotsitlarida esa bor. Harrop va Barron ikkala tur bilan ham tajriba o‘tkazishgan va bu farq ularning dalillashidagi asosiy tayanch bo‘lgan.

Sutemizuvchilar namunalarida bo‘yoq kislorod sarfini yigirma–ellik baravar oshirgan. Hujayralari avvaldan nafas olayotgan g‘oz qonida esa sarf tezligi hech qachon ikki baravardan ko‘proq oshmagan. Boshlang‘ich nafas olish qanchalik yuqori bo‘lsa, bo‘yoq qo‘sha oladigan hissa shunchalik kam bo‘lgan.

Xuddi shu bog‘liqlik bitta tur doirasida ham kuzatilgan. Haqiqiy politsitemiyasi bo‘lgan bemordan olingan, tarkibida yetilmagan hujayralar mavjud qon namunasi bo‘yoqsiz kislorodining 11.3 foizini iste’mol qilgan; sog‘lom donordan olingan yuvilgan hujayralarda bu ko‘rsatkich 2.8 foiz bo‘lgan. Bo‘yoq birinchi ko‘rsatkichni atigi 63.4 foizgacha oshirgan — olti baravar tezlashish; normal hujayralarda esa tezlashish qariyb o‘ttiz baravar bo‘lgan. Bo‘yoq yetilgan hujayralarni yetilmagan hujayralarga xos tarzda ishlashga undagan; mualliflar ham uning ta’sirini shunday izohlashgan.

Sianid buni to‘xtatishi kerak edi

Sianid hujayradagi oksidlanishni to‘xtatishi ma’lum edi. Shunga qaramay, Harrop va Barron uni bo‘yoq bilan birga qo‘shishgan.

Qoramol qoni bilan olingan natijalar umumiy holatni yaxshi ko‘rsatadi. Hech narsa qo‘shilmaganda uch soat ichida kislorod miqdori 22.61 hajm foizidan 22.03 hajm foizigacha tushgan. Metilen ko‘ki bilan u 12.84 gacha tushgan. Metilen ko‘ki va molyar konsentratsiyaning besh mingdan biriga teng kaliy sianid bilan esa 12.74 gacha tushgan. Bo‘yoqning ta’siri deyarli o‘zgarmagan.

Rasm: odam eritrotsitlarining uzluksiz mikronafas olish qaydi. Strelka metilen ko‘ki qo‘shilgan paytni ko‘rsatadi. Ungacha chiziq deyarli tekis; undan keyin muntazam ko‘tariladi. Harrop va Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928) maqolasidan qayta keltirilgan, PMID 19869478.

Ularning xulosasiga ko‘ra, bo‘yoq kislorod tashuvchi vazifasini bajarib, “sutemizuvchilarning yetilgan yadrosiz eritrotsitlaridan yo‘qolgan moddani yetkazib bergan”. Ikki yil o‘tib, Rockefeller institutida Michaelis va Salomon bu kelishmovchilikni keyinchalik ham saqlanib qolgan shaklda ifodalashgan. Yo bo‘yoqning ta’siri “bo‘yoqning tasodifiy xususiyati”, yo bo‘yoq “organizmlardagi qandaydir noma’lum moddaning modeli” edi. Bu ikki ehtimoldan qaysi biri to‘g‘ri ekani hali uzil-kesil hal qilinmagan. O‘zgargan jihat shuki, endi hujayralarni ancha aniqroq tavsiflash mumkin.

Jigar ekstrakti ham xuddi shunday ta’sir qilgan

Michaelis va Salomon a’zolarning sovuq suvli ekstraktlari ham xuddi shunday rag‘batlantiruvchi ta’sir ko‘rsatishini aniqlashgan. Kalamush jigari eng kuchli ta’sir qilgan, undan keyin buyrak, taloq va moyak turgan. Miya, mushak va qon zardobining ta’siri juda kam bo‘lgan yoki umuman kuzatilmagan.

Keyin ular ekstraktni uglerod monoksidi mavjudligida sinashgan. Ekstrakt yoki bo‘yoq keltirib chiqargan nafas olish 98 foiz uglerod monoksidi va 2 foiz kislorod aralashmasida o‘zgarmagan. Ayni gaz aralashmasi achitqilar va uy parrandalarining yadroli eritrotsitlarida nafas olishni taxminan 60–80 foizga susaytirgan. Bu Warburgning uglerod monoksidiga sezgir nafas olish fermenti haqidagi tavsifi bilan mos kelgan. Demak, to‘qimadagi noma’lum modda Warburg fermenti emas edi.

Jarayon davomida moddaning kimligini tushuntirishi mumkin bo‘lgan bir nechta nomzod chiqarib tashlangan. Qaytarilgan glutation va sistein faqat o‘zlarining oksidlanishi uchun zarur bo‘lgan miqdorda kislorod sarfini keltirib chiqargan. Harden va Young kofermenti ham rad etilgan, chunki uning eng ko‘p miqdori mushakda bo‘lsa-da, mushak deyarli eng kam ta’sir ko‘rsatgan. Bir necha yil avval nomlangan Keilin sitoxromi ham xuddi shu ziddiyatga duch kelgan. Faol modda hujayra yadrosidan kelib chiqadi, degan o‘z taxminlarini esa ular shunchaki taxmin deb atashgan.

Ta’sir muayyan sharoitlarga bog‘liq bo‘lgan

Hujayralar butun bo‘lishi kerak edi. Distillangan suv yoki takroriy muzlatish orqali gemoliz yuzaga keltirilganda, bo‘yoqqa ham, ekstraktga ham javob yo‘qolgan; qisman gemoliz esa javobni mutanosib ravishda kamaytirgan.

Shakar ham zarur edi. Glyukoza, fruktoza va saxaroza bo‘yoq keltirib chiqargan nafas olishni ta’minlagan; mannitol esa ta’minlamagan. Shakar bo‘lmaganda umuman nafas olish kuzatilmagan va jarayon davomida bo‘yoq hujayralarni shikastlayotgandek ko‘ringan. Shu sababli bir yoki ikki soatdan keyin qo‘shilgan glyukoza nafas olishni tiklamagan. Mualliflar bo‘yoq hujayra uchun zarur bo‘lgan tuzilmaviy tarkibiy qismni oksidlayotgan bo‘lishi mumkinligini taxmin qilishgan.

Yoritish bo‘yoqning ta’sirini sezilarli oshirgan, garchi ta’sir qorong‘ida ham yaqqol bo‘lgan. Boshqa qaytariladigan bo‘yoqlar turlicha ta’sir ko‘rsatgan: toluilen ko‘ki metilen ko‘kiga teng yoki undan kuchliroq ta’sir qilgan, indigo disulfonat esa deyarli ta’sir qilmagan. Bo‘yoqning oksidlanish-qaytarilish potensiali bilan ta’sir kuchi o‘rtasida aniq bog‘liqlik topilmagan. Mualliflar buni membrana o‘tkazuvchanligi va toksiklik bilan izohlashgan.

Ta’sir nafas olishga emas, fermentatsiyaga bog‘liq bo‘lgan

Barronning 1930-yilgi tadqiqotida hujayra suspenziyalaridan normal kalamush a’zolari va ko‘chirib o‘tkazilgan o‘smalarning to‘qima kesmalariga o‘tilgan.

Aerob glikoliz kuzatilmaydigan to‘qimalarda metilen ko‘ki hech qanday ta’sir ko‘rsatmagan yoki kislorod sarfini biroz susaytirgan: buyrakda taxminan 14 foizga, oshqozonosti bezida taxminan 14 foizga, jigarda taxminan 5 foizga. Kislorod mavjudligida fermentatsiya qiladigan to‘qimalarda esa sarfni oshirgan: taloqda taxminan 8 foizga, miyada taxminan 13 foizga. O‘smalarda o‘sish odam ko‘krak bezi karsinomasida taxminan 27 foizdan Rous tovuq sarkomasida 80 foizdan ko‘proqqacha bo‘lgan va har bir to‘qimaning aerob glikoliziga taxminan mutanosib kelgan.

Rasm: har bir nuqta bitta to‘qima turini bildiradi. Gorizontal o‘q — aerob glikoliz; vertikal o‘q — metilen ko‘ki qo‘shilgandan keyingi kislorod sarfining o‘zgarishi. Ma’lumotlar Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), 6-jadvaldan olingan, PMID 19869777.

Keyingi sianid tajribasi esa aks manzarani ko‘rsatgan. Ilgari javob bermagan o‘sha to‘qimalarda nafas olish sianid bilan to‘silib, fermentatsiya namoyon bo‘lganda, bo‘yoq kislorod sarfini yana oshirgan: buyrakda taxminan 59 foizga, jigarda taxminan 19 foizga, taloqda taxminan 286 foizga, moyakda taxminan 200 foizga.

Barron bo‘yoq hujayra yoki to‘qimaning fermentatsiya qobiliyatini tekshirish vositasi bo‘lishi mumkinligini taklif qilgan va maqolani bir taxmin bilan yakunlagan: bo‘yoq saqlovchi muhitda o‘sma kulturasini avlodlar davomida yetishtirish bir kun kelib o‘sma metabolizmini doimiy ravishda normal to‘qimanikiga o‘xshatishi mumkin. Bu 1930-yilda yozilgan tadqiqot savoli edi. Bu davolash haqidagi da’vo emas.

Tajribalar nimani o‘lchagan bo‘lishi mumkin emas

1928 va 1930-yillarda “nafas olish” kislorod sarfini anglatgan. Adenozin trifosfat haqida ilk bor 1929-yilda xabar berilgan, ajratib olingan mitoxondriyalar elektronlarni uzatish davomida fosfatni esterifikatsiya qilishi esa 1949-yilda ko‘rsatilgan. Metilen ko‘ki haqidagi dastlabki maqolalarning hech biri energiya hosil bo‘lishini o‘lchay olmagan va ularning hech biri bunday da’vo ham qilmagan.

Ikkinchi muammo — hujayralarning o‘zi. Sutemizuvchilarning yetilgan eritrotsitlarida mitoxondriyalar yo‘q. Retikulotsit bosqichida ular mitoxondriyalar va ribosomalarni selektiv autofagiya orqali yo‘qotadi. Shu sababli yetilgan qizil qon hujayrasi glikoliz hisobiga ishlaydi va pentoza-fosfat yo‘liga asosan ATP uchun emas, NADPH uchun tayanadi. 1928-yilgi tajribalarda tuzatish mumkin bo‘lgan elektron tashish zanjirining o‘zi mavjud bo‘lmagan. Kislorodni nima iste’mol qilgan bo‘lsa ham, u boshqa ishni bajarayotgan edi.

Bu boshqa jarayon nimadan iborat ekani hozir yetarlicha yaxshi tavsiflangan. Metilen ko‘ki hujayradagi qaytaruvchi ekvivalentlardan elektronlarni qabul qilib, leykometilen ko‘kiga aylanadi; u molekulyar kislorod ta’sirida qayta oksidlanib, siklni yakunlaydi. Odamning qizil qon hujayralarida qaytarilish bosqichini NADPH ga bog‘liq flavin reduktaza va unga aloqador disulfid reduktazalar bajaradi. Belgilangan glyukoza ishlatilgan 1976-yilgi tadqiqot bo‘yoq geksoza-monofosfat shuntini rag‘batlantirishini, past konsentratsiyadagi ta’sir oksigemoglobinga bog‘liqligini va yuqoriroq, 0.1 mM konsentratsiya vodorod peroksid hosil qilishini aniqlagan. Qaytarilgan bo‘yoq kislorod bilan uchrashganda fosfat bog‘larini emas, peroksid hosil qiladi.

Mitoxondriyalardagi holat ommabop sharhlarda ko‘rsatilganidan ko‘ra bahsliroq. Tadqiqotlarning bir yo‘nalishiga ko‘ra, bo‘yoq elektronlarni I kompleks sohasidan olib, sitoxrom c ga beradi. Boshqa bir tadqiqot sichqon miyasi mitoxondriyalarida bo‘yoq antimitsin bilan bloklashdan keyin nafas olishni tiklay olmasligini aniqlagan va elektron akseptori joyini III kompleksning ubixinol bog‘lanish nuqtasiga joylashtirgan. Uchinchi tadqiqot past konsentratsiyalar tinch holatdagi kislorod sarfini oshirganini, ammo ADP rag‘batlantirgan nafas olishni o‘zgartirmaganini aniqlagan. Asosiy fikrning eng bevosita ifodasi shuki, metilen ko‘ki keltirib chiqargan kislorod sarfi oksidlovchi fosforlanishga umuman bog‘liq emas: u nafas olish zanjiri susaytirilganda ham, bunday zanjiri bo‘lmagan preparatlarda ham saqlangan.

Bu ikki ko‘rsatkich o‘rtasidagi tafovutning bevosita o‘lchovlari ham mavjud. Ajratib olingan kalamush jigari mitoxondriyalarida bo‘yoq konsentratsiyasining oshishi nafas olish nazorati koeffitsiyentlarini pasaytirgan va shishishga sabab bo‘lgan; mualliflar buni oksidlovchi fosforlanishning ajralishi deb tavsiflashgan. Perfuziya qilingan kalamush jigarida metilen ko‘ki kislorod sarfini oshirgan, ATP ning ADP ga nisbati esa pasaygan.

Klinik kuzatuvlar ham xuddi shu mazmunni yetkazadi. Metgemoglobinemiya NADPH ga bog‘liq qaytarilish yo‘li orqali vena ichiga har kilogramm uchun taxminan bir–ikki milligramm metilen ko‘ki yuborish bilan davolanadi; kattaroq dozalar esa davolanayotgan holatning o‘zini keltirib chiqaradi. Ayni sharhda antidot ta’siri butun eritrotsitlarda eng yuqori bo‘lishi va gemoliz mavjudligida kamayishi qayd etilgan. Bu 1930-yildagi gemoliz haqidagi topilmaning yetmish uch yil o‘tib shifoxona sharoitida qayta namoyon bo‘lishidir. Foydali va zararli ta’sirlari dozaning muayyan chegarasi ikki tomonida joylashgan birikmaning dozasini kislorod sarfi o‘lchovidan kelib chiqib belgilash kerak emas.

Nega partiya ham muhokamaga kiradi

Harrop va Barron yana bir bor diqqat bilan o‘qishga arziydigan narsani payqashgan. Metilen ko‘kining o‘zi spektroskopda metgemoglobinga xos ikkita tasma orasida tasma hosil qiladi va bu “yuzaki tekshirishda osongina chalkashlikka sabab bo‘lishi mumkin”. Bo‘yoq izlanayotgan moddaning belgisini taqlid qilishi mumkin.

Xuddi shu muammoning kimyoviy ko‘rinishi ham bor. Oz miqdordagi tarkibiy qism sifatida mavjud bo‘lgan yaqin fenotiazinning o‘z oksidlanish-qaytarilish xususiyatlari, o‘z o‘tkazuvchanligi va o‘z toksikligi bo‘ladi. Hujjatlashtirilgan bir holat buning ahamiyatini aniq ko‘rsatadi: metilen ko‘kini yodlash bo‘yicha tadqiqotda taxminan 7–8 foiz Azure B saqlagan namunalar asosan yodlangan Azure B hosil qilgan. Shunday qilib, reaksiyada metilen ko‘ki emas, aralashma ustun bo‘lgan.

Metilen ko‘kini laboratoriyada, bo‘yash ish joyida yoki akvariumda reagent sifatida ishlatadigan har kim, agar partiyaning xususiyatlari aniqlanmagan bo‘lsa, tarkibi aniqlashtirilmagan ingredient bilan ishlayotgan bo‘ladi. Yaqin moddalar, moddaning identifikatsiyasi, element aralashmalari, qoldiq erituvchilar va kuydirishdan qolgan qoldiq — tajriba atrofidagi qog‘ozbozlik emas, tajribaning bir qismidir. Blupreme metilen ko‘kini farmatsevtika ishlab chiqaruvchisidan oladi va faqat og‘ir metallarni emas, butun USP spetsifikatsiyasini tekshirib, to‘liq tahlil sertifikatini e’lon qiladi. Tahlil sertifikatini o‘qish bo‘yicha qo‘llanma va USP darajasi belgisi nimani tasdiqlashi va nimani tasdiqlamasligi haqidagi maqola hujjatni bildirilgan da’vo bilan qanday solishtirishni tushuntiradi.

Raqam to‘g‘ri edi

1928 va 1930-yillardagi tajribalar puxta o‘tkazilgan va ularning asosiy kuzatuvi hanuz o‘z kuchida: qaytariladigan bo‘yoq deyarli nafas olmaydigan hujayrani sianid to‘sadigan bosqichdan o‘tmasdan, tinch holatdagi sarf tezligidan ko‘p baravar tez kislorod iste’mol qilishga undashi mumkin.

Xato keyinroq, “nafas olish” zamonaviy ma’noda talqin qilinganda yuzaga keladi. Gaz almashinuvi o‘lchovi elektronlar kislorodga yetib borganini bildiradi. U elektronlarning birortasi ATP hosil qilishga ishlatilganini bildirmaydi. Mitoxondriyasi yo‘q hujayrada esa bu ikki fikr o‘rtasidagi tafovut nihoyatda katta. Metilen ko‘kining hujayralardagi ta’sirlarining kengroq xaritasi ayni farqni kengroq doirada ko‘rsatadi, birikmaning bo‘yoqdan dorigacha bo‘lgan tarixi esa to‘qimachilik bo‘yog‘i dastlab bu tajribalarga qanday kirib kelganini tushuntiradi.