وہ تجربات جنہوں نے میتھیلین بلیو کو خلوی تنفس سے جوڑا

انسانی خون، جس سے فائبرن نکال دیا گیا ہو، تین گھنٹے تک 37 °C پر رکھنے سے اپنے اندر موجود آکسیجن کا تقریباً دو فی صد استعمال کرتا ہے۔ انکیوبیشن سے پہلے اس میں میتھیلین بلیو کی تھوڑی سی مقدار شامل کر دیں تو یہی خون تقریباً پینسٹھ فی صد آکسیجن استعمال کرتا ہے۔ خلیوں میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ صرف محلول بدلا۔

یہ عدد جانز ہاپکنز میں جارج ہیروپ اور ای۔ ایس۔ گوزمان بیرن کے 1928 کے ایک مقالے سے آیا ہے، اور یہی اس بار بار دہرائے جانے والے بیان کی بنیاد ہے کہ میتھیلین بلیو خلوی تنفس کو بہتر بناتا ہے۔ یہ بیان غلط نہیں، لیکن اس کا مفہوم بظاہر محسوس ہونے سے زیادہ محدود ہے۔

جدول کا عدد دراصل کیا ناپتا ہے

ناپا جانے والا حتمی اشاریہ آکسیجن کی کھپت تھا، جس کا تعین گیس کے تجزیے سے کیا گیا۔ ہیروپ اور بیرن نے تازہ لیے گئے خون کو 10 °C پر روئی سے چھان کر سفید خلیے نکالے، نمونے کو آکسیجن سے سیر کیا، اسے دو حصوں میں تقسیم کیا، ایک حصے میں رنگ شامل کیا، اور انکیوبیشن کے بعد دونوں کا تجزیہ کیا۔ سفید خلیوں کی تعداد شاذ ہی تقریباً ایک ہزار فی مکعب ملی میٹر سے زیادہ تھی۔ آکسیجن کی کھپت کو نمونے میں ابتدا میں موجود آکسیجن کے اس حصے کے طور پر رپورٹ کیا گیا جو ختم ہو چکا تھا۔

انہوں نے کاربن ڈائی آکسائیڈ بھی ناپی، مگر یہاں طریقۂ کار نے مشکل پیدا کی۔ فائبرن سے پاک خون انکیوبیشن کے پہلے گھنٹے میں فی 100 mL دو ملی مول تک کاربن ڈائی آکسائیڈ خارج کرتا تھا، ایسی وجوہ سے جن کا زیرِ مطالعہ تعامل سے تعلق نہیں تھا۔ اس لیے مکمل خون سے حاصل شدہ تنفسی نسبتیں قابلِ استعمال نہیں تھیں۔ صرف لاک کے محلول میں دھوئے ہوئے خلیوں سے قابلِ تشریح اعداد ملے، اور رنگ کی موجودگی اور عدم موجودگی، دونوں میں یہ 0.73 اور 0.80 کے درمیان رہے۔

یہ تفصیل غیر اہم نہیں۔ ان مقالوں میں «تنفس» کا مطلب ایک بند برتن کے اندر گیسوں کا تبادلہ ہے۔ آکسیجن کی کھپت اور قابلِ استعمال توانائی کی پیداوار کے درمیان فرق کا الگ سے جائزہ آکسیجن کی کھپت ATP کے بارے میں کیا بتاتی ہے اور کیا نہیں میں لیا گیا ہے۔

جہاں خلیوں کا تنفس سب سے کم تھا، وہاں رنگ نے سب سے زیادہ اضافہ کیا

ممالیہ کے پختہ سرخ خلیوں میں آکسیجن کی قابلِ پیمائش کھپت تقریباً نہیں ہوتی۔ پرندوں کے مرکزہ رکھنے والے سرخ خلیوں میں ہوتی ہے۔ ہیروپ اور بیرن نے دونوں پر تجربات کیے، اور یہی فرق ان کی دلیل کی بنیاد ہے۔

ممالیہ کے نمونوں میں رنگ نے کھپت کو بیس سے پچاس گنا بڑھایا۔ ہنس کے خون میں، جس کے خلیے پہلے ہی تنفس کرتے تھے، شرح کبھی دو گنا سے زیادہ نہیں ہوئی۔ ابتدائی تنفس جتنا زیادہ تھا، رنگ اتنا ہی کم اضافہ کر سکا۔

ایک ہی نوع کے اندر بھی یہی تدریجی فرق نظر آتا ہے۔ پولی سائتھیمیا ویرا کے ایک مریض کے خون کے نمونے میں ناپختہ خلیے موجود تھے۔ رنگ کے بغیر اس نے اپنی آکسیجن کا 11.3 فی صد استعمال کیا، جبکہ ایک صحت مند عطیہ دہندہ کے دھوئے ہوئے خلیوں نے 2.8 فی صد استعمال کیا۔ رنگ نے اسے صرف 63.4 فی صد تک پہنچایا، یعنی رفتار میں چھ گنا اضافہ، جبکہ معمول کے خلیوں میں تقریباً تیس گنا اضافہ ہوا۔ رنگ نے پختہ خلیوں کو ناپختہ خلیوں جیسے رویّے کی طرف دھکیلا، اور مصنفین نے بھی یہی کہا تھا کہ وہ ایسا کر رہا ہے۔

سائنائیڈ کو اسے روک دینا چاہیے تھا

یہ معلوم تھا کہ سائنائیڈ خلوی تکسید کو روکتا ہے۔ اس کے باوجود ہیروپ اور بیرن نے رنگ کے ساتھ اسے بھی شامل کیا۔

گائے کے خون کے نتائج اس کی نمائندہ مثال ہیں۔ کسی اضافے کے بغیر تین گھنٹوں میں آکسیجن کی مقدار 22.61 سے گھٹ کر 22.03 حجمی فی صد ہوئی۔ میتھیلین بلیو کے ساتھ یہ 12.84 تک گر گئی۔ میتھیلین بلیو اور ایک پانچ ہزارواں مولر پوٹاشیم سائنائیڈ کے ساتھ یہ 12.74 تک گر گئی۔ رنگ کا اثر بنیادی طور پر برقرار رہا۔

شکل: انسانی سرخ خلیوں کے مائیکرو تنفس کا مسلسل ریکارڈ۔ تیر میتھیلین بلیو شامل کیے جانے کی نشاندہی کرتا ہے۔ اس سے پہلے خط تقریباً ہموار ہے؛ اس کے بعد وہ مسلسل اوپر جاتا ہے۔ ہیروپ اور بیرن، Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928)، PMID 19869478 سے دوبارہ پیش کیا گیا۔

ان کا نتیجہ یہ تھا کہ رنگ آکسیجن کے حامل کے طور پر کام کرتا ہے، «ایک ایسا مادہ فراہم کرتے ہوئے جو بالغ ممالیہ کے بے مرکزہ سرخ خلیوں سے غائب ہو چکا ہے۔» دو سال بعد راک فیلر انسٹی ٹیوٹ میں مائیکلس اور سالومن نے اس اختلاف کو اس کی مستقل صورت میں بیان کیا۔ یا تو رنگ کا اثر «رنگ کی ایک اتفاقی خاصیت» تھا، یا رنگ «جانداروں میں موجود کسی نامعلوم مادے کا نمونہ» تھا۔ ان دو امکانات کے درمیان فیصلہ اب تک نہیں ہوا۔ تبدیلی یہ آئی ہے کہ اب خلیوں کی کہیں زیادہ درست وضاحت کی جا سکتی ہے۔

جگر کے ایک عرق نے بھی یہی کام کیا

مائیکلس اور سالومن نے دکھایا کہ ٹھنڈے پانی سے نکالے گئے اعضا کے عرق بھی یہی تحریک پیدا کرتے ہیں۔ چوہے کے جگر کا اثر سب سے زیادہ تھا، اس کے بعد گردے، تلی اور خصیے کا۔ دماغ، پٹھے اور خون کے سیرم کا اثر بہت کم یا بالکل نہیں تھا۔

پھر انہوں نے عرق کو کاربن مونو آکسائیڈ کے مقابل آزمایا۔ عرق یا رنگ، دونوں سے پیدا ہونے والا تنفس 98 فی صد کاربن مونو آکسائیڈ اور 2 فی صد آکسیجن کے آمیزے میں برقرار رہا۔ اسی گیس آمیزے نے خمیر اور مرغی کے مرکزہ رکھنے والے سرخ خلیوں کے تنفس کو تقریباً 60 سے 80 فی صد تک روکا، جو کاربن مونو آکسائیڈ سے متاثر ہونے والے تنفسی انزائم کے بارے میں واربرگ کی وضاحت کے مطابق تھا۔ لہٰذا بافت کا وہ نامعلوم مادہ واربرگ کا انزائم نہیں تھا۔

اس تلاش میں کئی ممکنہ شناختیں مسترد ہوئیں۔ مختزل گلوٹاتھائیون اور سسٹین نے صرف اتنی آکسیجن استعمال کی جتنی ان کی اپنی تکسید کے لیے درکار تھی۔ ہارڈن اور ینگ کے کوانزائم کو اس لیے خارج کیا گیا کہ وہ پٹھوں میں سب سے زیادہ موجود ہوتا ہے، جبکہ پٹھوں نے تقریباً سب سے کم اثر دکھایا۔ کیلن کے سائٹوکروم، جسے چند سال پہلے نام دیا گیا تھا، کے ساتھ بھی یہی تضاد سامنے آیا۔ ان کا اپنا خیال کہ فعال مادہ خلیے کے مرکزے سے آتا ہے، ان کے بقول محض ایک تجویز تھا۔

اس اثر کے لیے کچھ شرائط ضروری تھیں

خلیوں کا سالم ہونا ضروری تھا۔ مقطر پانی یا بار بار منجمد کرنے سے ہونے والی ہیمولائسز نے رنگ اور عرق، دونوں کے ردِعمل کو ختم کر دیا، اور جزوی ہیمولائسز نے اسے اسی تناسب سے کم کیا۔

شکر بھی ضروری تھی۔ گلوکوز، فرکٹوز اور سکروز نے رنگ سے پیدا ہونے والے تنفس کو سہارا دیا؛ مینیٹول نے نہیں۔ شکر کی عدم موجودگی میں بالکل تنفس نہیں ہوا، اور اس عمل کے دوران رنگ بظاہر خلیوں کو نقصان پہنچاتا تھا، اس لیے ایک یا دو گھنٹے بعد گلوکوز شامل کرنے سے تنفس بحال نہیں ہوا۔ مصنفین نے تجویز کیا کہ رنگ خلیے کے ایک ایسے ساختی جز کی تکسید کر رہا تھا جس کی خلیے کو ضرورت تھی۔

روشنی نے رنگ کا اثر خاصا بڑھایا، اگرچہ اندھیرے میں بھی اثر واضح تھا۔ دوسرے قابلِ اختزال رنگوں نے مختلف رویّہ دکھایا: ٹولیولین بلیو نے میتھیلین بلیو کے برابر یا اس سے زیادہ اثر دکھایا، جبکہ انڈیگو ڈائی سلفونیٹ نے تقریباً کچھ نہیں کیا۔ کسی رنگ کے تکسیدی و اختزالی پوٹینشل اور اس کے اثر کی شدت کے درمیان کوئی واضح تعلق سامنے نہیں آیا، جس کی وجہ مصنفین نے جھلی کی نفوذ پذیری اور زہریلے پن کو قرار دیا۔

اثر کا تعلق تخمیر سے تھا، تنفس سے نہیں

بیرن کا 1930 کا مطالعہ خلیوں کے سسپنشن سے آگے بڑھ کر چوہے کے معمول کے اعضا اور پیوند شدہ رسولیوں کی بافتوں کے باریک قتلے استعمال کرنے لگا۔

جن بافتوں میں ایروبک گلائیکولائسز نہیں تھی، ان میں میتھیلین بلیو نے یا تو کوئی اثر نہیں کیا یا آکسیجن کی کھپت معمولی کم کی: گردے میں تقریباً 14 فی صد، لبلبے میں تقریباً 14 فی صد، جگر میں تقریباً 5 فی صد۔ آکسیجن کی موجودگی میں تخمیر کرنے والی بافتوں میں اس نے کھپت بڑھائی: تلی میں تقریباً 8 فی صد، دماغ میں تقریباً 13 فی صد۔ رسولیوں میں اضافہ انسانی چھاتی کے کارسینوما میں تقریباً 27 فی صد سے لے کر راؤس مرغی کے سارکوما میں 80 فی صد سے زیادہ تک تھا، جو تقریباً ہر بافت کی ایروبک گلائیکولائسز کے متناسب تھا۔

شکل: ہر نقطہ بافت کی ایک قسم ہے۔ افقی محور ایروبک گلائیکولائسز ہے؛ عمودی محور میتھیلین بلیو کے بعد آکسیجن کی کھپت میں تبدیلی ہے۔ اعداد بیرن، Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930)، جدول 6، PMID 19869777 سے لیے گئے ہیں۔

پھر سائنائیڈ کے تجربے نے اس کی الٹ صورت دکھائی۔ جب پہلے ردِعمل نہ دکھانے والی ان بافتوں میں سائنائیڈ سے تنفس روکا گیا اور تخمیر نمایاں ہوئی، تو رنگ نے دوبارہ آکسیجن کی کھپت بڑھائی: گردے میں تقریباً 59 فی صد، جگر میں تقریباً 19 فی صد، تلی میں تقریباً 286 فی صد، خصیے میں تقریباً 200 فی صد۔

بیرن نے تجویز کیا کہ رنگ کسی خلیے یا بافت کی تخمیری صلاحیت جانچنے کا ذریعہ بن سکتا ہے، اور آخر میں ایک قیاس پیش کیا: رنگ والے میڈیم میں رسولی کے کلچر کی کئی نسلیں شاید ایک دن رسولی کے میٹابولزم کو مستقل طور پر معمول کی بافت جیسا بنا دیں۔ یہ 1930 میں لکھا گیا ایک تحقیقی سوال تھا۔ یہ علاج کا دعویٰ نہیں ہے۔

یہ تجربات کیا نہیں ناپ سکتے تھے

1928 اور 1930 میں «تنفس» سے مراد آکسیجن کی کھپت تھی۔ اڈینوسین ٹرائی فاسفیٹ پہلی بار 1929 میں رپورٹ ہوا، اور الگ کیے گئے مائٹوکونڈریا کے الیکٹران منتقل کرتے وقت فاسفیٹ کی ایسٹریفکیشن کرنے کا ثبوت 1949 میں سامنے آیا۔ میتھیلین بلیو کے ابتدائی مقالوں میں سے کوئی بھی توانائی کی پیداوار نہیں ناپ سکتا تھا، اور کسی نے ایسا کرنے کا دعویٰ بھی نہیں کیا۔

دوسرا مسئلہ خود خلیے ہیں۔ ممالیہ کے پختہ سرخ خلیوں میں مائٹوکونڈریا نہیں ہوتے۔ ریٹیکیولوسائٹ کے مرحلے میں وہ انتخابی آٹوفیجی کے ذریعے مائٹوکونڈریا اور رائبوسوم نکال دیتے ہیں۔ اسی لیے پختہ سرخ خلیہ گلائیکولائسز پر چلتا ہے اور اپنے پینٹوز فاسفیٹ راستے پر بنیادی طور پر ATP کے بجائے NADPH کے لیے انحصار کرتا ہے۔ 1928 کے تجربات میں مرمت کے لیے کوئی الیکٹران ٹرانسپورٹ چین موجود ہی نہیں تھی۔ جو بھی آکسیجن استعمال کر رہا تھا، وہ کوئی اور کام کر رہا تھا۔

وہ دوسرا کام کیا تھا، اب اس کی معقول حد تک اچھی وضاحت موجود ہے۔ میتھیلین بلیو خلیے کے اختزالی مساویات سے الیکٹران قبول کرتا ہے اور لیوکومیتھیلین بلیو بن جاتا ہے، جس کی سالماتی آکسیجن دوبارہ تکسید کرتی ہے، یوں چکر مکمل ہو جاتا ہے۔ انسانی سرخ خلیوں میں NADPH پر منحصر فلیون ریڈکٹیز اور متعلقہ ڈائی سلفائیڈ ریڈکٹیز اختزال کا مرحلہ انجام دیتے ہیں۔ نشان زدہ گلوکوز استعمال کرنے والے 1976 کے ایک مطالعے میں معلوم ہوا کہ رنگ ہیکسوز مونو فاسفیٹ شنٹ کو متحرک کرتا ہے، کہ کم ارتکاز پر اس کا اثر آکسی ہیموگلوبن پر منحصر تھا، اور کہ زیادہ ارتکاز، 0.1 mM، نے ہائیڈروجن پرآکسائیڈ پیدا کی۔ ایک مختزل رنگ جب آکسیجن سے ملتا ہے تو پرآکسائیڈ بناتا ہے، فاسفیٹ بند نہیں۔

مائٹوکونڈریا میں صورتِ حال عام فہم خلاصوں کے اعتراف سے زیادہ متنازع ہے۔ تحقیق کا ایک سلسلہ یہ مؤقف رکھتا ہے کہ رنگ کمپلیکس I کے علاقے سے الیکٹران لیتا ہے اور انہیں سائٹوکروم c کے حوالے کرتا ہے۔ ایک اور مطالعے نے پایا کہ چوہے کے دماغ کے مائٹوکونڈریا میں یہ اینٹی مائسین کی رکاوٹ کے بعد تنفس بحال نہیں کر سکتا، اور اس نے الیکٹران قبول کرنے والے مقام کو اس کے بجائے کمپلیکس III کے یوبی کوئنول سے بندھنے والے مقام پر رکھا۔ تیسرے مطالعے نے پایا کہ کم ارتکاز نے حالتِ آرام میں آکسیجن کی کھپت بڑھائی، جبکہ ADP سے متحرک تنفس میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ اس نکتے کا سب سے براہِ راست بیان یہ ہے کہ میتھیلین بلیو سے پیدا ہونے والی آکسیجن کی کھپت تکسیدی فاسفوریلیشن پر بالکل منحصر نہیں: تنفسی زنجیر روکے جانے پر بھی یہ برقرار رہی، اور ایسی تیاریوں میں بھی جن میں یہ زنجیر موجود نہیں تھی۔

ان دونوں مقداروں کے درمیان فرق کی براہِ راست پیمائشیں بھی موجود ہیں۔ چوہے کے جگر کے الگ کیے گئے مائٹوکونڈریا میں رنگ کے بڑھتے ہوئے ارتکاز نے تنفسی کنٹرول کی نسبتیں کم کیں اور سوجن پیدا کی، جسے مصنفین نے تکسیدی فاسفوریلیشن کا غیر مربوط ہونا قرار دیا۔ چوہے کے پرفیوژن والے جگر میں میتھیلین بلیو نے آکسیجن کی کھپت بڑھائی، جبکہ ATP کی ADP سے نسبت گر گئی۔

طبی ریکارڈ بھی یہی پیغام دیتا ہے۔ میتھیموگلوبینیمیا کا علاج NADPH پر منحصر اختزالی راستے کے ذریعے، تقریباً ایک سے دو ملی گرام میتھیلین بلیو فی کلوگرام وریدی طور پر دے کر کیا جاتا ہے، اور زیادہ خوراکیں وہی کیفیت پیدا کرتی ہیں جس کا علاج کیا جا رہا ہوتا ہے۔ اسی جائزے میں بتایا گیا ہے کہ تریاقی اثر سالم سرخ خلیوں میں سب سے زیادہ ہوتا ہے اور ہیمولائسز کی موجودگی میں کم ہو جاتا ہے۔ یوں 1930 میں ہیمولائسز سے متعلق دریافت تہتر سال بعد ہسپتال کے ماحول میں دوبارہ سامنے آئی۔ جس مرکب کے مفید اور نقصان دہ اثرات خوراک کی ایک حد کے دو مخالف طرف ہوں، اس کی خوراک آکسیجن کی کھپت کی پیمائش سے اخذ نہیں کرنی چاہیے۔

بیچ کو اس بحث میں شامل کرنا کیوں ضروری ہے

ہیروپ اور بیرن نے ایک ایسی بات نوٹ کی جو دوبارہ پڑھنے کے لائق ہے۔ میتھیلین بلیو خود طیف بین میں میتھیموگلوبن کی دو مخصوص پٹیوں کے درمیان ایک پٹی بناتا ہے، «جو سرسری معائنے میں آسانی سے الجھن پیدا کر سکتی ہے۔» رنگ اس مادے کی نقل کر سکتا ہے جسے تلاش کیا جا رہا ہو۔

یہی مسئلہ کیمیائی صورت میں بھی موجود ہے۔ معمولی جز کے طور پر موجود کوئی متعلقہ فینوتھیازین اپنا الگ تکسیدی و اختزالی رویّہ، اپنی نفوذ پذیری اور اپنا زہریلا پن رکھتا ہے۔ ایک دستاویزی مثال اس معاملے کی اہمیت واضح کرتی ہے: میتھیلین بلیو کی آیوڈینیشن کے ایک مطالعے میں تقریباً 7 سے 8 فی صد Azure B رکھنے والے نمونوں نے بنیادی طور پر آیوڈین شدہ Azure B بنایا، اس لیے تعامل پر میتھیلین بلیو کے بجائے نجاست غالب رہی۔

جو بھی میتھیلین بلیو کو بطور ری ایجنٹ استعمال کرتا ہے، چاہے تجربہ گاہ میں، رنگ آمیزی کی میز پر یا ایکویریم میں، وہ ایک غیر متعین جز کے ساتھ کام کر رہا ہوتا ہے، جب تک بیچ کی خصوصیات متعین نہ کی گئی ہوں۔ متعلقہ مادے، شناخت، عنصری نجاستیں، باقی ماندہ سالوینٹس اور جلانے کے بعد بچ جانے والی باقیات تجربے کا حصہ ہیں، محض اس کے اردگرد کی کاغذی کارروائی نہیں۔ Blupreme اپنا میتھیلین بلیو ایک ادویہ ساز ادارے سے حاصل کرتا ہے اور تجزیے کا مکمل سرٹیفکیٹ شائع کرتا ہے، جس میں صرف بھاری دھاتوں کے بجائے پوری USP تصریح کی جانچ کی جاتی ہے؛ تجزیے کا سرٹیفکیٹ پڑھنے کی رہنمائی اور USP گریڈ کی نسبت کیا ثابت کرتی ہے اور کیا نہیں میں بتایا گیا ہے کہ دستاویز کو دعوے کے مقابل کیسے جانچا جائے۔

عدد درست تھا

1928 اور 1930 کے تجربات احتیاط سے کیے گئے تھے، اور ان کا مرکزی مشاہدہ آج بھی برقرار ہے: ایک قابلِ اختزال رنگ ایسے خلیے کو، جو بمشکل تنفس کرتا ہے، اپنی حالتِ آرام کی شرح سے کئی گنا زیادہ آکسیجن استعمال کرنے پر آمادہ کر سکتا ہے، اس مرحلے سے گزرے بغیر جسے سائنائیڈ روکتا ہے۔

غلطی بعد میں پیدا ہوتی ہے، جب «تنفس» کو اس کے جدید معنی میں پڑھا جاتا ہے۔ گیسوں کے تبادلے کی پیمائش یہ بتاتی ہے کہ الیکٹران آکسیجن تک پہنچے۔ یہ نہیں بتاتی کہ ان میں سے کسی کو ATP بنانے کے لیے استعمال کیا گیا، اور جس خلیے میں مائٹوکونڈریا نہ ہوں، وہاں ان دونوں بیانات کے درمیان فاصلہ انتہائی وسیع ہوتا ہے۔ خلیوں میں میتھیلین بلیو کے افعال کا وسیع تر نقشہ اسی فرق کو ایک بڑے تناظر میں رکھتا ہے، اور رنگ سے دوا تک اس مرکب کی تاریخ واضح کرتی ہے کہ کپڑوں کو رنگنے والا مادہ ابتدا میں ان تجربات تک کیسے پہنچا۔