Як метиленовий синій проникає в клітини: відновлення, повторне окиснення, поглинання

Якщо спостерігати, як ендотеліальні клітини в чашці поглинають метиленовий синій, очевидне пояснення водночас буде хибним. Середовище втрачає синій колір, у клітинах з’являються сині гранули — отже, барвник нібито пройшов крізь мембрану у вигляді синьої молекули. Експерименти свідчать про інше. Синя форма майже не проходить крізь мембрану. Проходить безбарвна форма, а синій колір, який ви бачите всередині, виникає вже там, після проникнення.

Ця зміна погляду важлива, бо визначає, що забарвлення може й не може нам сказати. Сині гранули вказують на окиснений барвник, який повторно окиснився й затримався в органелах. Вони не відображають загальної кількості барвника в клітині, не показують його відновленого пулу й не вимірюють біологічного ефекту. Щоб зрозуміти чому, простежмо три етапи: відновлення на поверхні, дифузію відновленої форми, повторне окиснення й утримання всередині.

Дві форми поводяться як різні молекули

Окиснений метиленовий синій — це плоска, позитивно заряджена система кілець. Він розчиняється у воді, сильно поглинає світло в діапазоні приблизно від 600 до 700 нанометрів і має синій колір. Ключове тут — заряд. Заряджена гідрофільна молекула не проходить легко крізь ліпідну мембрану, тому в літературі обережно говорять про відносну мембранну непроникність, а не про повну непроникність.

Відновлений метиленовий синій, який називають лейкометиленовим синім, безбарвний, незаряджений і жиророзчинний. Приберіть заряд — і мембрана перестане бути стіною. Відновлена молекула легко дифундує крізь неї, а потрапивши до компартмента з більш окиснювальними умовами, може знову втратити електрони й повернутися до синьої, зарядженої форми, що утримується всередині. Тому окисно-відновна хімія барвника водночас є механізмом його транспорту. Зміна кількості електронів змінює проникність.

Електрони для першого етапу надходять від самої клітини. Клітини ссавців здійснюють перенесення електронів крізь плазматичну мембрану, переміщуючи відновні еквіваленти від внутрішньоклітинних донорів назовні, до акцепторів на поверхні. Така трансплазмамембранна активність є нормальною функцією клітин, притаманною більшості їхніх типів. Поверхнева редуктаза ендотелію, що відновлює тіазинові барвники, має одну показову спільну рису з іншими редуктазами: вона продовжує працювати за наявності ціаніду й азиду в дозах, які блокують подальші етапи. Саме це розмежування — ключ до всієї історії.

Розподіл між фазами дослідили першим, і він майже пояснив поглинання

У 1929 році Маріан Ірвін із Рокфеллерівського інституту поставила простіше запитання. Можливо, проникнення барвника — це лише його розподіл між водою та жировими шарами клітини, а в лабораторній моделі ці шари може замінити шар хлороформу. У своїх спектрофотометричних дослідженнях проникнення вона струшувала водні розчини барвників із хлороформом і порівнювала те, що переходило в органічну фазу, з тим, що проникало в живі клітини водоростей.

Два результати цієї роботи й досі заслуговують на увагу. По-перше, комерційні розчини метиленового синього містили триметилтіонін, який нині називають Azure B. Ця домішка проникала швидше, ніж сам метиленовий синій, особливо за лужного pH, коли переважає жиророзчинна форма вільної основи. Частина того, що здавалося проникненням метиленового синього, насправді була вибірковим проникненням Azure B. По-друге, pH визначав результат через стан іонізації, а пошкоджені клітини пропускали значно більше барвника, ніж неушкоджені. Коефіцієнти розподілу та зарядовий стан визначали, що поглинали штучна система й жива клітина, а подібність між ними підтримувала уявлення про неводні шари на межі клітини.

Модель завбачливо враховувала роль ліпідів та іонізації, але не могла відрізнити барвник, який розподіляється між фазами у своїй початковій формі, від барвника, який хімічно перетворюється на поверхні, проходить крізь мембрану в іншій формі й перетворюється назад усередині. Для цього розмежування був потрібен інший експеримент, який провели сімдесят років потому на легеневому ендотелії.

Відновлення зовні, утримання всередині

Меркер і колеги працювали з культивованими ендотеліальними клітинами легеневої артерії великої рогатої худоби та запропонували триетапну послідовність: окиснений барвник відновлюється на поверхні клітини до своєї безбарвної ліпофільної форми, відновлена форма дифундує всередину, а внутрішньоклітинне повторне окиснення відтворює непроникну для мембрани окиснену форму, яка накопичується. Потім у своєму дослідженні поглинання тіазинових барвників ендотелієм вони перевірили цю послідовність, намагаючись перервати її на конкретних етапах.

Першим інструментом був фериціанід — акцептор електронів, який не може проникнути в клітину. Коли поверхневі ферменти відновлюють синій барвник до його безбарвної форми поза клітиною, фериціанід може забрати ці електрони назад і відтворити синій барвник у середовищі ще до того, як той пройде крізь мембрану. Доки фериціанід був у надлишку (10 мікромолярів барвника проти 50–500 мікромолярів фериціаніду), поглинання барвника майже припинялося. Лише після вичерпання фериціаніду воно відновлювалося зі звичайною швидкістю. Кінетика підтверджувала те саме іншим способом. Фериціанід зникав із приблизно сталою швидкістю, що узгоджувалося зі сталим потоком відновлення на поверхні, який підтримував циклічну роботу медіатора, тоді як позаклітинний барвник зникав експоненційно в міру вичерпання його пулу. Сталий потік у поєднанні з виснаженням пулу означає, що сигнал фериціаніду відображає безперервне відновлення, а не вихід молекул барвника з розчину.

Другий інструмент повністю виключав етап проходження крізь мембрану. Дослідники приєднали толуїдиновий синій O, близький тіазиновий аналог, до великого поліакриламідного ланцюга, надто великого для проникнення в клітину в будь-якому стані окиснення. Клітини все одно відновлювали зв’язаний барвник. Отже, для відновлення не потрібен доступ усередину клітини. Відповідний механізм розташований на поверхні або електрично з нею пов’язаний.

Далі відбулося розмежування, відображене в назві статті. Ціанід і азид у концентрації 2 мілімоляри сильно пригнічували накопичення барвника, а під мікроскопом темно-сині й фіолетові включення, які зазвичай оточують ядро, майже зникали. Проте жоден із цих інгібіторів не сповільнював позаклітинного відновлення: циклічні перетворення фериціаніду тривали без послаблення, а непроникний полімер і далі відновлювався. Блокування відбувалося на пізнішому етапі. Ціанід і азид зупиняли внутрішньоклітинне повторне окиснення й секвестрацію, а не поверхневе відновлення. Перевірки життєздатності підтверджували таке тлумачення: під час цих впливів клітини зберігали свій цитозольний маркерний фермент лактатдегідрогеназу, тож зниження поглинання не було просто наслідком отруєння чи розриву мембрани.

Одне застереження з цієї роботи залишається актуальним. Сині включення розташовувалися навколо ядра, але не в ньому, що узгоджується з окисненням усередині субклітинних органел, проте дослідження не встановило, яких саме. Подібні картини в інших типах клітин називали лізосомальними на підставі слабких доказів. Вважайте утримання встановленим фактом, а його точне місце — попереднім припущенням. Читачі, які стежать за тим, куди електрони рухаються далі, можуть перейти до мітохондріального транспорту електронів та окисно-відновних процесів і ширшої картини всмоктування та розподілу залежно від шляху надходження.

Забарвлення — не експозиція

Третє дослідження показує, що відбувається, коли ця логіка поглинання поєднується з вимірюванням біологічного показника. Скотт і колеги виявили, що метил-бета-циклодекстрин, молекула цукру у формі кільцеподібного тора, безпосередньо зв’язує метиленовий синій. Константа асоціації для комплексу включення становить приблизно 310 обернених молярів, тоді як для димеризації барвника — близько 5846 обернених молярів. У фібробластах L929 це зв’язування блокувало і забарвлення клітин, і стимуляцію поглинання глюкози: попередня інкубація з циклодекстрином запобігала синьому забарвленню, а його додавання згодом прискорювало знебарвлення. У міру зникнення оптичного синього сигналу з клітин посилений транспорт глюкози згасав у тісній відповідності з ним.

Автори витлумачили цю кореляцію як аргумент на користь прямої взаємодії барвника з білком у шляху активації транспортера глюкози, а не механізму тривалого окиснювального стресу. Цей висновок обґрунтований, але має межі. Експеримент не визначає конкретного білка, не демонструє зв’язування із самим транспортером, а кореляція між знебарвленням і втратою ефекту не може виключити всі шляхи, опосередковані окисно-відновними процесами.

Головний висновок стосується вимірювання. Оптичне забарвлення відображає видимий, окиснений, пов’язаний із клітинами барвник. Воно повністю пропускає безбарвний відновлений пул, тому бліда клітина все ще може містити еквіваленти барвника, а інтенсивно забарвлена клітина свідчить про утриманий окиснений барвник, а не про загальну експозицію тканин чи величину ефекту. Те саме застереження стосується й більших масштабів: порівняння забарвлення між типами клітин або трактування темного зрізу тканини як доказу вищої експозиції повторює початкову помилку зі спостереженням у чашці. Поглинання — це цикл відновлення, дифузії та повторного окиснення, і будь-який окремий знімок синьої форми показує лише один його аспект. Звідси безпосередньо випливають практичні наслідки для лабораторного забарвлення та роботи з барвником і для тлумачення тверджень про дозу та експозицію.