Пауль Ерліх і метиленовий синій: як барвник допоміг сформувати підхід до відкриття ліків

Внеском Пауля Ерліха в медицину був не лікарський засіб. Це було обґрунтування того, як слід його досліджувати.

У 1878 році він подав докторську дисертацію, перший розділ якої мав назву «Хімічне розуміння забарвлення». Її основна думка полягала в тому, що забарвлення зрізу тканини й фарбування шматка полотна підпорядковуються однаковій логіці. В обох випадках колір закріплюється завдяки хімічній спорідненості між барвником і матеріалом, а не тому, що тканина вбирає рідину, містить жир або має форму, здатну затримувати пігмент. Зростаючи, Ерліх спостерігав, як його двоюрідний брат, патолог Карл Вайгерт, готував забарвлені зрізи. Його увагу привертали не зображення, а те, що барвник сам обирав, куди потрапити.

Це твердження здається скромним. Насправді це не так. Якщо барвник зв’язується з тканиною з хімічних причин, то картина забарвлення повідомляє про хімію цієї тканини. Забарвлений мікропрепарат перестає бути ілюстрацією й стає вимірюванням.

Він одразу розвинув цю думку. У 1880 році Ерліх поєднав метиленовий синій із кислим фуксином і назвав суміш нейтральним барвником, neutralen Farbkörper. Вона давала змогу розрізняти типи лейкоцитів там, де окремі барвники, які тоді використовували, цього не дозволяли. Через два роки він представив метод забарвлення туберкульозних паличок метиловим фіолетовим, і Кох застосував цю процедуру у власній роботі.

Теорія, яка згодом дала цим практикам спільне підґрунтя, — окрема тема, а час її появи часто спрощують. Теорія бічних ланцюгів Ерліха — ідея про те, що речовина діє на клітину завдяки їхній хімічній сумісності, — належить до 1890-х років, а не до періоду дослідів із барвниками. Ранні роботи заклали попереднє переконання: вибірковість має хімічну природу, а отже, її можна цілеспрямовано шукати, а не натрапляти на неї випадково.

Експеримент, який перетворив барвник на карту

У 1885 році Ерліх опублікував монографію про потребу організму в кисні з підзаголовком «Кольорово-аналітичне дослідження». Метод полягав у введенні барвників, колір яких залежить від ступеня окиснення, з подальшим порівнянням того, як різні органи їх відновлювали або зберігали незміненими. Барвник використовували як вимірювальний інструмент, подібно до термометра: він повідомляв про умови всередині тканини, які неможливо було дослідити безпосередньо. Сам Ерліх формулював мету як визначення відновлювальної здатності живих органів за допомогою певних барвників.

Результат із метиленовим синім з’явився у 1886 році в статті про реакцію барвника з живою нервовою речовиною, яку було представлено медичному товариству в грудні попереднього року. Метиленовий синій вводили в кровообіг живої тварини, а потім вилучали тонкі зрізи тканини й піддавали їх дії повітря, щоб накопичений безбарвний барвник знову окислився до синьої форми та показав, де він зосередився. Нервові клітини й нервові волокна забарвлювалися, причому достатньо вибірково, щоб ця техніка стала стандартним методом виявлення нервової тканини. Сполука вже не була лише барвною речовиною, яку наносили на мертвий зріз на лабораторному столі. Вона стала маркером, що розподілявся всередині живого тіла, і цей розподіл можна було зчитати.

Властивість, що лежить в основі обох експериментів, варто назвати прямо, адже від неї залежить усе інше в цій історії. Перетворення метиленового синього оборотне. Його відновлена форма, лейкометиленовий синій, безбарвна, а під час контакту з киснем вона знову перетворюється на синій катіон. Розчин барвника з глюкозою в герметично закритій банці безбарвний; якщо відкрити банку, він стає синім. За наявними повідомленнями, Ерліх демонстрував це безпосередньо, обробляючи забарвлені зрізи хлоридом заліза, а також піддаючи їх дії повітря й спостерігаючи повернення кольору. Барвник, який змінює колір залежно від окисно-відновного стану свого оточення, є зондом для дослідження цього оточення.

Отже, поруч існували дві властивості. Барвник міг відрізняти одну тканину від іншої. І його забарвлення можна було вмикати й вимикати зміною ступеня окиснення.

Якщо дивитися ретроспективно, друга властивість — це початок хіміотерапії. Якщо сполука зв’язується з одним типом тканини, але не з іншим, то та сама сполука може досягати одного виду організмів, але не іншого. Ерліх прямо сформулював висновок: якщо збудника можна вибірково забарвити, забарвлення може вказувати на специфічне ушкодження цього збудника. Отже, барвник потенційно можна було використовувати як ліки, спрямовані проти чужорідного організму, а не проти пацієнта.

Перше випробування на пацієнті стосувалося не малярії. У 1890 році Ерліх разом із психіатром Артуром Леппманном повідомив, що метиленовий синій полегшував біль за невралгічних і ревматичних уражень м’язів, суглобів та сухожиль. Вони обговорювали, чи може препарат діяти на психічні захворювання, і вирішили не випробовувати його. Італійський лікар П’єтро Бодоні з Генуї все ж це зробив. Назва його статті 1899 року вказує на седативну дію за різних форм психозу: він описав заспокоєння чотирнадцяти збуджених пацієнтів і зазначив, що інші генуезькі лікарі вже використовували барвник із тією самою метою. Седація — це не вплив на саме захворювання, і ця відмінність раз у раз постає в цій історії.

Робота з малярією відбулася у 1891 році разом із патологом Паулем Гуттманном у лікарні Моабіт у Берліні. Метиленовий синій дали двом пацієнтам, а звіт з’явився в Berliner klinische Wochenschrift від 28 вересня 1891 року. У першому випадку пацієнт прийняв 0.5 g барвника одноразово ввечері 29 червня; очікуваний напад не розвинувся повною мірою, а єдиною скаргою, зафіксованою після цього, була легка странгурія із синім забарвленням сечі. Напади гарячки зникли протягом перших днів, а паразити зникли з крові щонайпізніше на восьмий день. Самі автори підсумували, що їхні очікування повністю справдилися. Два випадки без контрольної групи не є доказом. Докладніший виклад теми метиленового синього й малярії, зокрема сучасних випробувань, належить окремій сторінці. Тут цікаве вужче питання: яка частина міркувань Ерліха витримала зіткнення з паразитом.

Де міркування витримали перевірку, а де — ні

Від запропонованого механізму збереглося небагато, принаймні в тому вигляді, який пропонував Ерліх. Струнка версія, за якою плоский трициклічний катіон прослизає між парами основ ДНК паразита, не витримує перевірки на Plasmodium. Метиленовий синій настільки легко відновлюється в інфікованому еритроциті, що взагалі не досягає паразита у формі планарного катіона, а пояснення через інтеркаляцію, яке підходить для акридинових барвників, до нього не застосовне.

Картина, яку підтверджують дані, менш упорядкована. Метиленовий синій пригнічує глутатіонредуктазу паразита за концентрацій, досяжних у пацієнта. Він блокує перетворення гему на гемозоїн — інертний пігмент, який паразит утворює, щоб уникнути отруєння продуктами власного перетравлення гемоглобіну, — приблизно так само ефективно, як хлорохін, і значно ефективніше за хінін. Його окисно-відновне циклування також утворює активні форми кисню в клітині, яка вже їх продукує. Який із цих механізмів є визначальним і чи всі вони роблять свій внесок, досі не встановлено.

Є й додаткове ускладнення, яке слід враховувати, читаючи будь-яке історичне твердження про цю сполуку. Комерційний метиленовий синій того періоду не був однією речовиною. Зразки містили Azure B, монодеметильований структурний аналог, а в старіших розчинах його накопичувалося більше. Azure B — метахроматичний барвник з іншими мішенями: він забарвлює дволанцюгову ДНК у темно-синій колір, а РНК — у зелений. Суміш двох барвників із різними напрямками розподілу, у пропорціях, яких ніхто не фіксував, не дає підстав для однозначного твердження про те, що саме робив метиленовий синій у її складі.

Сам барвник так і не витіснив хінін. Метод виявився успішнішим. Учень Ерліха Вільгельм Рель, працюючи в концерні барвників і лікарських засобів IG Farben, продовжував просувати похідні барвників як ліки від тропічних хвороб і запропонував відсутній інструмент: канарку, заражену пташиною малярією, як стандартну модель для скринінгу сполук-кандидатів. Потім Вернер Шулеманн змінив бічний ланцюг, і отримана фенотіазинієва сіль вилікувала експериментальну інфекцію. Вона й далі забарвлювала пацієнтів у синій колір.

Результатом, який витримав час, виявився не барвник і не система кілець, а бічний ланцюг. Додавання діалкіламіноалкіламіногрупи змінило поведінку молекули, і цей фрагмент зберігся під час усіх подальших переробок. Якщо зберегти цю групу й замінити фенотіазинієве кільце на акридинове, результатом буде хінакрин. Якщо замінити його на хінолінове — хлорохін. Памахін, примахін і амодіахін, які досі належать до переліку протималярійних засобів, містять ту саму групу. Сполука, яка не досягла успіху як засіб лікування, дала фрагмент, який виявився успішним.

Зв’язок з антипсихотиками проходить через кільце, а не через препарат. Саме з’ясування структури метиленового синього привело Генріха Августа Бернтсена до вихідного фенотіазинового ядра у 1883 році. І саме над цим каркасом із різними замісниками працювали хіміки Rhône-Poulenc у 1940-х роках, шукаючи антигістамінні засоби. Одну з цих сполук синтезували приблизно наприкінці 1950 року, а хірург Анрі Лаборі випробував її та помітив, що вона робить пацієнтів спокійними й байдужими. Перше опубліковане застосування в психіатрії, у пацієнта з манією, відбулося в січні 1952 року. Перший антипсихотик — радше далекий родич барвника, з якого почав Ерліх, ніж нащадок його протималярійного засобу.

Три звички, які варто перейняти з цієї історії

1. «Перший синтетичний лікарський засіб, використаний у медицині» описує категорію, а застережень тут більше, ніж підказує саме формулювання. Ця фраза стала звичною; часто цитований огляд Ширмера та колег у Neurobiology of Aging називає метиленовий синій найпершим повністю синтетичним лікарським засобом, використаним у медицині. Хлоралгідрат почали застосовувати як синтетичний седативний засіб у 1869 році, більш ніж на двадцять років раніше. Сама стаття 1891 року дає частину відповіді, адже її автори називають синтетичні жарознижувальні засоби, які вже виявилися неефективними проти малярії, серед них хінолін, антипірин та антифебрин. Власний миш’яковмісний засіб Ерліха проти сифілісу з’явився ще пізніше. Обґрунтована версія цього твердження стосується методу, а не першості: метиленовий синій належить до найраніших синтетичних сполук, обраних для дії проти конкретного організму на основі хімічної теорії вибірковості.
2. Вибірковий розподіл не означає вибіркової користі. Результат Ерліха 1886 року полягав у тому, що барвник потрапляє до нервової тканини. Куди потрапляє сполука і що вона робить, діставшись туди, — це два різні вимірювання, причому перше виконати значно легше. Саме в цьому розриві відтоді й існує більшість тверджень про метиленовий синій і мозок.
3. Чистота належить до доказів, а не до маркетингу. Історичні дані неоднозначні саме з цієї причини. Невеликі структурні відмінності змінюють те, куди потрапляє ця сполука, тому сертифікат аналізу має бути прив’язаний до конкретної партії, а не подаватися як загальне твердження, що продукт перевірено. Продавець, який заявляє про відповідність фармакопейній монографії, але перевіряє лише важкі метали, стверджує більше, ніж підтверджує звіт. Blupreme отримує метиленовий синій від фармацевтичного виробника та перевіряє повну специфікацію, визначену монографією: ідентифікацію, чистоту, органічні домішки, залишкові розчинники, елементні домішки, залишок після прожарювання, мікробіологічні показники та бактеріальні ендотоксини. Звіт публікується разом із продуктом, а сторінка про метиленовий синій якості USP пояснює ці граничні значення й те, чому результат щодо Azure B слід перевіряти насамперед.

Хронологія за джерелами

Хронологічну послідовність ключових подій, зокрема хімію барвників до Ерліха та класи якості й специфікації після нього, окремо викладено в історії метиленового синього, а про саму сполуку розповідає матеріал що таке метиленовий синій.

Ілюстративні матеріали, що лежать в основі цього викладу й відтворені в огляді Крафтс, Гемпельманна та Скурської-Стані 2012 року, не рівнозначні, і один приклад показує чому. Ілюстрація 1891 року — це первинний запис випробування; портрет 1910 року поруч із нею лише фіксує репутацію на той час і нічого більше. Сторінки із записника Андерзага 1934 року — це безпосередній слід заміни на хінолінове кільце, записаний рукою самого хіміка.

Чесний підсумок дослідів Ерліха з барвниками такий: він правильно визначив вибірковість і мішень, але помилився щодо механізму. Метиленовий синій справді концентрується в нервовій тканині й справді шкодить малярійному паразиту. Друге не є наслідком першого, а запропоноване ним хімічне пояснення обох явищ було хибним. Те, що він довів беззаперечно, виявилося довговічнішим за правильний механізм: сполуку можна обрати, а не випадково знайти, причому обрати на основі даних, зібраних ще до того, як хтось дасть її пацієнту.