Метилен зәңгәрен күзәнәк сулышы белән бәйләгән тәҗрибәләр

Фибрины алынган кеше каны, өч сәгать дәвамында 37 °C температурада тотылганда, үзендәге кислородның якынча ике процентын сарыф итә. Инкубация алдыннан аз күләмдә метилен зәңгәре өстәсәң, шул ук кан кислородның якынча алтмыш биш процентын сарыф итә. Күзәнәкләрнең үзендә берни дә үзгәрмәгән. Эремә генә үзгәргән.

Бу сан Джонс Хопкинс университетындагы Джордж Харроп һәм Э. С. Гусман Барронның 1928 елгы мәкаләсеннән алынган. Метилен зәңгәре күзәнәк сулышын яхшырта дигән киң таралган фикер шуннан башлана. Бу фикер ялган түгел, әмма аның мәгънәсе беренче карашка тоелганнан таррак.

Җәдвәлдәге сан чынлыкта нәрсәне үлчи

Үлчәнгән күрсәткеч газ анализы ярдәмендә билгеләнгән кислород сарыф итү булган. Харроп һәм Баррон яңа гына алынган канны, ак кан күзәнәкләрен аеру өчен, 10 °C температурада мамык аша сөзгәннәр, үрнәкне кислород белән туендырганнар, ике өлешкә бүлгәннәр, бер өлешенә буягыч өстәгәннәр һәм инкубациядән соң икесен дә анализлаганнар. Лейкоцитлар саны бер куб миллиметрга якынча меңнән сирәк арткан. Кислород сарыф итү үрнәктә башта булган кислородның юкка чыккан өлеше буларак күрсәтелгән.

Алар углерод диоксидын да үлчәгәннәр, әмма монда ысул кыенлык тудырган. Фибрины алынган кан инкубациянең беренче сәгатендә, өйрәнелгән реакциягә бәйле булмаган сәбәпләр аркасында, һәр 100 mL га ике миллимольгә кадәр углерод диоксиды бүлеп чыгарган. Шуңа күрә бөтен кан өчен сулыш коэффициентларын кулланып булмаган. Локк эремәсендәге юылган күзәнәкләр генә аңлатырга мөмкин булган күрсәткечләр биргән, һәм алар буягыч белән дә, аннан башка да 0.73 белән 0.80 арасында тупланган.

Бу вак-төяк түгел. Әлеге мәкаләләрдә «сулыш» ябык савыт эчендәге газ алмашынуын аңлата. Кислород сарыф итү белән файдалы энергия җитештерү арасындагы аерма кислород сарыф итү ATP турында нәрсә әйтә һәм нәрсә әйтми дигән мәкаләдә аерым карала.

Буягыч күзәнәкләр иң аз сулаган очракларда иң зур өстәмә тәэсир биргән

Имезүчеләрнең өлгергән эритроцитларында үлчәп булырлык кислород сарыф итү диярлек юк. Кошларның төшле эритроцитларында исә ул бар. Харроп һәм Баррон икесен дә тикшергәннәр, һәм алар арасындагы аерма авторларның дәлилләү нигезен тәшкил итә.

Имезүчеләрдән алынган үрнәкләрдә буягыч кислород сарыф итүне егерме-илле тапкыр арттырган. Күзәнәкләре инде сулаган каз канында ул тизлекне беркайчан да ике тапкырдан күбрәк арттырмаган. Башлангыч сулыш никадәр югарырак булса, буягычның өстәмә тәэсире шулкадәр кечерәк булган.

Шул ук закончалык бер төр эчендә дә күренә. Чын полицитемияле пациенттан алынган, өлгермәгән күзәнәкләр булган кеше каны үрнәге буягычсыз кислородының 11.3 процентын сарыф иткән, ә сәламәт донорның юылган күзәнәкләре — 2.8 процентын. Буягыч беренче күрсәткечне нибары 63.4 процентка җиткергән: нормаль күзәнәкләрдә тизлек утыз тапкырга якын арткан булса, монда ул алты тапкыр гына арткан. Буягыч өлгергән күзәнәкләрнең эшләвен өлгермәгәннәрнекенә якынайткан; авторлар да аның тәэсирен шулай аңлатканнар.

Цианид моны туктатырга тиеш булган

Цианидның күзәнәкләрдәге оксидлашуны туктатуы билгеле булган. Шулай да Харроп һәм Баррон аны буягыч белән бергә өстәгәннәр.

Сыер каны белән алынган нәтиҗәләр моны ачык күрсәтә. Берни дә өстәлмәгәндә, өч сәгать эчендә кислород күләме 22.61 күләм процентыннан 22.03 кә төшкән. Метилен зәңгәре белән ул 12.84 кә төшкән. Метилен зәңгәре һәм моляр концентрациянең биш меңнән бере кадәр калий цианиды белән ул 12.74 кә төшкән. Буягычның тәэсире асылда үзгәрмәгән.

Рәсем: кеше эритроцитларының микросулышын өзлексез теркәү. Ук метилен зәңгәре өстәлгән мизгелне күрсәтә. Аңа кадәр сызык диярлек горизонталь; аннан соң ул тотрыклы күтәрелә. Харроп һәм Барронның Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928) мәкаләсеннән кабат бирелә, PMID 19869478.

Алар буягыч кислород ташучы булып эшли, «өлгергән имезүчеләрнең төшсез эритроцитларыннан юкка чыккан матдәне тәэмин итә» дигән нәтиҗәгә килгәннәр. Ике елдан соң Рокфеллер институтындагы Михаэлис һәм Саломон бу каршылыкны бүген дә актуаль булган рәвештә тасвирлаганнар. Буягычның тәэсире я «буягычның очраклы үзлеге», яисә буягыч «организмнардагы ниндидер билгесез матдәнең моделе» булган. Бу ике аңлатма арасындагы сайлау әле дә хәл ителмәгән. Үзгәргән нәрсә — хәзер күзәнәкләрне күпкә төгәлрәк тасвирлап була.

Бавыр экстракты да шул ук тәэсирне күрсәткән

Михаэлис һәм Саломон органнардан салкын су белән алынган экстрактларның шундый ук стимуллаштыру бирүен күрсәткәннәр. Иң көчле тәэсирне күсе бавыры күрсәткән, аннан соң бөер, талак һәм орлык бизе килгән. Баш мие, мускул һәм кан сүле бик аз тәэсир иткән яки бөтенләй тәэсир итмәгән.

Аннары алар экстрактны углерод монооксиды шартларында сынаганнар. Экстракт яки буягыч китереп чыгарган сулыш 98 процент углерод монооксиды һәм 2 процент кислород катнашмасында үзгәрмәгән. Шул ук газ катнашмасы чүпрә сулышын һәм кошларның төшле эритроцитлары сулышын якынча 60–80 процентка киметкән. Бу Варбургның углерод монооксидына сизгер сулыш ферменты турындагы аңлатмасына туры килгән. Димәк, тукымадагы билгесез матдә Варбург ферменты булмаган.

Тикшерү барышында берничә фараз кире кагылган. Кайтарылган глутатион һәм цистеин үзләренең оксидлашуы өчен кирәкле күләмдә генә кислород сарыф итүгә китергән. Харден һәм Янг коферменты да кире кагылган, чөнки ул иң күп мускулда булган, ә мускул иң аз тәэсир күрсәткән тукымаларның берсе булган. Берничә ел элек исеме бирелгән Кейлин цитохромы да шул ук каршылыкка очраган. Актив матдә күзәнәк төшеннән килә дигән үз фаразларын авторлар бары тик фараз дип кенә атаганнар.

Тәэсир билгеле шартларга бәйле булган

Күзәнәкләр бөтен булырга тиеш булган. Дистилляцияләнгән су яки кабат-кабат туңдыру китереп чыгарган гемолиз буягычка да, экстрактка да җавапны юкка чыгарган, ә өлешчә гемолиз аны үз дәрәҗәсенә пропорциональ рәвештә киметкән.

Шикәр дә кирәк булган. Глюкоза, фруктоза һәм сахароза буягыч китереп чыгарган сулышны тәэмин иткән; маннитол тәэмин итмәгән. Шикәр булмаганда сулыш бөтенләй күзәтелмәгән, һәм буягыч шул вакытта күзәнәкләргә зыян китергән кебек булган: бер яки ике сәгатьтән соң глюкоза өстәү сулышны кире кайтармаган. Авторлар буягыч күзәнәккә кирәкле структур компонентны оксидлаштыра дип фаразлаганнар.

Яктылык буягычның тәэсирен сизелерлек арттырган, әмма тәэсир караңгыда да ачык күренгән. Кайтарылырга сәләтле башка буягычлар үзләрен башкача тоткан: толуилен зәңгәре метилен зәңгәре кадәр яки аннан да көчлерәк тәэсир иткән, ә индиго дисульфонаты диярлек берни дә эшләмәгән. Буягычның оксидлашу-кайтарылу потенциалы белән тәэсиренең зурлыгы арасында ачык бәйләнеш табылмаган; авторлар моны мембрана аша үтү сәләте һәм агулылык белән аңлатканнар.

Тәэсир сулышка түгел, ә ачытуга туры килгән

Барронның 1930 елгы тикшерүе күзәнәк суспензияләреннән нормаль күсе органнарының һәм күчереп утыртылган шешләрнең тукыма кисемнәренә күчкән.

Аэроб гликолиз булмаган тукымаларда метилен зәңгәре берни дә үзгәртмәгән яки кислород сарыф итүне бераз киметкән: бөердә якынча 14 процентка, ашказаны асты бизендә якынча 14 процентка, бавырда якынча 5 процентка. Кислород булганда ачыту бара торган тукымаларда ул сарыф итүне арттырган: талакта якынча 8 процентка, баш миендә якынча 13 процентка. Шешләрдәге арту кеше күкрәк бизе карциномасында якынча 27 проценттан Раус тавык саркомасында 80 проценттан артыгракка кадәр җиткән һәм һәр тукыманың аэроб гликолизына якынча пропорциональ булган.

Рәсем: һәр нокта бер тукыма төрен күрсәтә. Горизонталь күчәр — аэроб гликолиз; вертикаль күчәр — метилен зәңгәре өстәгәннән соң кислород сарыф итүнең үзгәреше. Мәгълүматлар Барронның Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930) мәкаләсендәге 6 нчы җәдвәлдән алынган, PMID 19869777.

Аннары цианид белән үткәрелгән тәҗрибә капма-каршы күренеш биргән. Элегрәк җавап бирмәгән шул тукымаларда сулыш цианид белән тоткарлангач һәм ачыту ачык күренә башлагач, буягыч кислород сарыф итүне яңадан арттырган: бөердә якынча 59 процентка, бавырда якынча 19 процентка, талакта якынча 286 процентка, орлык бизендә якынча 200 процентка.

Баррон буягычны күзәнәкнең яки тукыманың ачыту сәләтен сынау өчен кулланып була дип тәкъдим иткән һәм мәкаләсен бер фараз белән тәмамлаган: буягыч булган мохиттә шеш культурасын буыннан-буынга үстерү беркөнне шешнең матдәләр алмашынуын даими рәвештә нормаль тукыманыкына охшаш итә алыр. Бу 1930 елда язылган тикшеренү соравы булган. Ул дәвалау турындагы дәгъва түгел.

Тәҗрибәләр нәрсәне үлчи алмаган

1928 һәм 1930 елларда «сулыш» кислород сарыф итүне аңлаткан. Аденозинтрифосфат турында беренче хәбәр 1929 елда чыккан, ә аерып алынган митохондрияләрнең электроннарны күчергәндә фосфатны этерификацияләвен 1949 елда гына күрсәткәннәр. Метилен зәңгәре турындагы беренче хезмәтләрнең берсе дә энергия җитештерүне үлчи алмаган, һәм берсе дә моны эшләдек дип белдермәгән.

Икенче мәсьәлә — күзәнәкләрнең үзләре. Имезүчеләрнең өлгергән эритроцитларында митохондрияләр юк. Ретикулоцит стадиясендә алар сайлап баручы аутофагия аша митохондрияләрдән һәм рибосомалардан арыналар. Шуңа күрә өлгергән кызыл кан күзәнәге гликолиз исәбенә эшли һәм үзенең пентозофосфат юлына ATP өчен түгел, ә нигездә NADPH өчен таяна. 1928 елгы тәҗрибәләрдә төзәтергә мөмкин булган электрон күчерү чылбыры булмаган. Кислородны сарыф иткән процесс башка эш башкарган.

Бу башка процессның нәрсә булуы хәзер шактый яхшы тасвирланган. Метилен зәңгәре күзәнәкнең кайтаручы эквивалентларыннан электроннар кабул итә һәм лейкометилен зәңгәренә әверелә; аны молекуляр кислород яңадан оксидлаштыра, һәм цикл йомыклана. Кешенең кызыл кан күзәнәкләрендә кайтарылу этабын NADPH ка бәйле флавинредуктаза һәм аңа якын дисульфидредуктазалар башкара. Тамгаланган глюкоза кулланылган 1976 елгы тикшерү буягычның гексозомонофосфат шунтын стимуллаштыруын, түбән концентрациядәге тәэсирнең оксигемоглобинга бәйле булуын, ә югарырак — 0.1 mM — концентрациянең водород пероксиды барлыкка китерүен ачыклаган. Кайтарылган буягыч кислород белән очрашканда фосфат бәйләнешләре түгел, ә пероксид барлыкка килә.

Митохондрияләрдәге күренеш популяр кыскача аңлатмаларда танылганнан бәхәслерәк. Бер тикшеренү юнәлеше буенча, буягыч электроннарны I комплекс өлкәсеннән ала һәм аларны c цитохромына тапшыра. Икенче тикшеренү тычканның баш мие митохондрияләрендә аның антимицин белән тоткарланганнан соң сулышны кире кайтара алмавын ачыклаган һәм электрон кабул итү урынын III комплексның убихинол бәйләү үзәгендә урнаштырган. Өченче тикшеренү түбән концентрацияләрнең тыныч хәлдә кислород сарыф итүне арттыруын, ә ADP белән стимуллаштырылган сулышны үзгәрешсез калдыруын күрсәткән. Төп фикернең иң туры формулировкасы шул: метилен зәңгәре китереп чыгарган кислород сарыф итү оксидлашулы фосфорлашуга бөтенләй бәйле түгел — ул сулыш чылбыры тоткарланганда да, мондый чылбыр булмаган препаратларда да дәвам иткән.

Бу ике күрсәткеч арасындагы аерманы турыдан-туры үлчәүләр дә бар. Күсе бавырыннан аерып алынган митохондрияләрдә буягыч концентрациясен арттыру сулыш контроле коэффициентларын киметкән һәм шешенү китереп чыгарган. Авторлар моны оксидлашулы фосфорлашуның аерылуы дип тасвирлаганнар. Перфузияләнгән күсе бавырында метилен зәңгәре кислород сарыф итүне арттырган, шул ук вакытта ATP ның ADP га нисбәте кимегән.

Клиник мәгълүматлар да шул ук фикерне күрсәтә. Метгемоглобинемияне NADPH ка бәйле кайтарылу юлы аша килограммга якынча бер-ике миллиграмм метилен зәңгәрен вена эченә кертеп дәвалыйлар, ә зуррак дозалар дәвалана торган хәлнең үзен китереп чыгара. Шул ук күзәтү мәкаләсендә антидот тәэсиренең бөтен эритроцитларда иң көчле булуы һәм гемолиз булганда кимүе билгеләнә. Бу — 1930 елдагы гемолиз нәтиҗәсенең җитмеш өч елдан соң хастаханә шартларында яңадан күренүе. Файдалы һәм зарарлы тәэсирләре доза чигенең ике ягында урнашкан кушылманың дозасын кислород сарыф итүне үлчәүдән чыгып билгеләргә ярамый.

Ни өчен партия турында да сөйләшергә кирәк

Харроп һәм Баррон кабат укып карарга лаеклы бер нәрсәне искәрткәннәр. Метилен зәңгәре үзе спектроскопта метгемоглобинның ике хас сызыгы арасында бер сызык тудыра, һәм бу «өстән-өстән генә караганда җиңел буталуга китерергә мөмкин». Буягыч эзләнә торган матдәгә охшап күренә ала.

Шул ук мәсьәләнең химик ягы да бар. Аз күләмле компонент буларак булган охшаш фенотиазинның үз оксидлашу-кайтарылу үзлекләре, үз үтеп керү сәләте һәм үз агулылыгы бар. Документлаштырылган бер очрак моның әһәмиятен ачык күрсәтә: метилен зәңгәрен йодлау тикшерүендә якынча 7–8 процент Azure B булган үрнәкләр нигездә йодланган Azure B биргән. Шулай итеп, реакциядә метилен зәңгәре түгел, ә катнашма өстенлек иткән.

Метилен зәңгәрен лабораториядә, буяу өстәлендә яки аквариумда реагент буларак кулланган һәркем, партиянең үзлекләре билгеләнмәгән булса, составы төгәл ачыкланмаган ингредиент белән эш итә. Охшаш матдәләр, матдәнең тәңгәллеге, элемент катнашмалары, калдык эреткечләр һәм кыздырганнан соңгы калдык — тәҗрибә тирәсендәге кәгазь эше түгел, ә аның бер өлеше. Blupreme метилен зәңгәрен фармацевтика җитештерүчесеннән ала һәм авыр металларны гына түгел, бөтен USP спецификациясен тикшереп, тулы анализ сертификатын бастыра; анализ сертификатын уку буенча кулланма һәм USP дәрәҗәсе билгесе нәрсәне раслый һәм нәрсәне расламый дигән мәкалә документны белдерелгән дәгъва белән ничек чагыштырырга икәнен аңлата.

Сан дөрес булган

1928 һәм 1930 елгы тәҗрибәләр җентекле үткәрелгән, һәм аларның төп күзәтүе бүген дә дөрес булып кала: кайтарылырга сәләтле буягыч сулыш активлыгы бик түбән булган күзәнәкне, цианид тоткарлый торган этапны үтмичә, тыныч хәлдәгегә караганда күп тапкыр күбрәк кислород сарыф итәргә мәҗбүр итә ала.

Хата соңрак, «сулыш» сүзен хәзерге мәгънәсендә укыганда барлыкка килә. Газ алмашынуын үлчәү электроннарның кислородка барып җитүен күрсәтә. Ул шул электроннарның берәрсе ATP ясау өчен кулланылганмы-юкмы икәнен күрсәтми. Митохондрияләре булмаган күзәнәктә бу ике фикер арасындагы аерма мөмкин кадәр зур. Метилен зәңгәренең күзәнәкләрдәге тәэсирләренең киңрәк картасы шул ук аерманы киңрәк кысаларда күрсәтә, ә кушылманың буягычтан даруга кадәрге тарихы тукыма буягычының бу тәҗрибәләргә ничек килеп эләгүен аңлата.