Metilen mavisi hücrelere nasıl girer: indirgenme, yeniden oksitlenme, hücreye alım

Bir kaptaki endotel hücrelerinin metilen mavisini almasını izlediğinizde, ilk akla gelen yorum aynı zamanda yanlış olandır. Ortam mavi rengini kaybeder, hücrelerde mavi granüller oluşur; öyleyse boya membrandan mavi molekül olarak geçmiş olmalıdır. Deneyler ise aksini söyler. Mavi form membrandan neredeyse hiç geçmez. Geçen, renksiz formdur; içeride gördüğünüz mavi renk ise hücreye girişten sonra, içeride oluşur.

Bu tersine işleyiş önemlidir, çünkü boyanmanın neyi gösterip neyi gösteremeyeceğini belirler. Mavi granüller, yeniden oksitlenmiş ve organellerde tutulmuş oksitlenmiş boyayı gösterir. Hücredeki toplam boyayı göstermezler, indirgenmiş boya havuzunu yansıtmazlar ve biyolojik etkiyi ölçmezler. Nedenini anlamak için üç adımı izleyin: yüzeyde indirgenme, indirgenmiş formun difüzyonu, içeride yeniden oksitlenme ve tutulma.

İki form farklı moleküller gibi davranır

Oksitlenmiş metilen mavisi, düzlemsel ve pozitif yüklü bir halka sistemidir. Suda çözünür, yaklaşık 600 ila 700 nanometre aralığında ışığı güçlü biçimde soğurur ve mavi görünür. Belirleyici olan yüktür. Yüklü, suyu seven bir molekül lipid membrandan kolayca geçmez; bu nedenle literatürde kullanılan özenli ifade, membran geçirgenliğinin hiç olmadığı değil, görece düşük olduğudur.

Lökometilen mavisi olarak adlandırılan indirgenmiş metilen mavisi renksiz, yüksüz ve yağda çözünürdür. Yük ortadan kalktığında membran artık bir duvar olmaktan çıkar. İndirgenmiş molekül membrandan kolayca difüze olur; daha oksitleyici bir bölmeye girdikten sonra yeniden elektron kaybederek mavi, yüklü ve içeride tutulan forma dönebilir. Dolayısıyla boyanın redoks kimyası aynı zamanda onun taşınma mekanizmasıdır. Elektron sayısını değiştirdiğinizde geçirgenliği de değiştirirsiniz.

İlk adım için gereken elektronlar hücrenin kendisinden gelir. Memeli hücreleri, hücre içindeki vericilerden yüzeydeki alıcılara doğru indirgeme eşdeğerlerini aktararak plazma membranı boyunca elektron taşınmasını sağlar. Plazma membranını aşan bu etkinlik, çoğu hücre tipinde bulunan normal bir hücresel işlevdir. Tiyazin boyalarını işleyen endotel yüzey redüktazı, önemli bir açıdan diğerleri gibi davranır: sonraki adımları durduran dozlarda siyanür ve azit bulunduğunda da çalışmayı sürdürür. Tüm açıklamanın kilit noktası bu ayrımdır.

Önce fazlar arası dağılım incelendi ve hücreye alımı neredeyse açıklıyordu

1929'da Rockefeller Enstitüsü'nden Marian Irwin daha basit bir soru sordu. Belki de boyanın hücreye girişi, su ile hücrenin yağlı katmanları arasındaki dağılımdan ibaretti ve laboratuvarda bir kloroform tabakası bu yağlı katmanların yerini tutabilirdi. Irwin, spektrofotometrik penetrasyon çalışmalarında sulu boya çözeltilerini kloroformla çalkaladı ve organik faza geçen miktarı, canlı alg hücrelerine giren miktarla karşılaştırdı.

Bu çalışmanın iki bulgusu hâlâ dikkat çekicidir. İlk olarak, ticari metilen mavisi çözeltileri, günümüzde azure B olarak adlandırılan trimetil tiyonin içeriyordu. Bu safsızlık, özellikle lipidlerde çözünen serbest baz formunun baskın olduğu alkali pH koşullarında, metilen mavisinin kendisinden daha hızlı nüfuz ediyordu. Metilen mavisinin hücreye girişi gibi görünen bazı durumlar, aslında azure B'nin seçici girişiydi. İkinci olarak, pH iyonlaşma durumunu belirleyerek sonucu şekillendiriyordu ve hasarlı hücreler, sağlam hücrelerden çok daha fazla boya alıyordu. Dağılım katsayıları ve yük durumu, hem yapay sistemin hem de canlı hücrenin neyi aldığını belirliyordu. İkisi arasındaki benzerlik, hücre sınırında sulu olmayan katmanların bulunduğu fikrini destekliyordu.

Model, lipidler ve iyonlaşma konusunda ileri görüşlüydü; ancak kendi kimyasal formuyla fazlar arasında dağılan bir boya ile yüzeyde kimyasal dönüşüme uğrayıp farklı bir formda membranı geçen ve içeride yeniden eski formuna dönen bir boyayı ayırt edemiyordu. Bu ayrım için farklı bir deney gerekiyordu ve bu deney yetmiş yıl sonra akciğer endotelinde gerçekleştirildi.

Dışarıda indirgenme, içeride tutulma

Merker ve çalışma arkadaşları, kültürde yetiştirilen sığır pulmoner arter endotel hücreleriyle çalışarak üç adımlı bir süreç önerdi: oksitlenmiş boya hücre yüzeyinde renksiz, lipofilik formuna indirgenir; indirgenmiş form içeri difüze olur; hücre içindeki yeniden oksitlenme ise membran geçirgenliği düşük olan oksitlenmiş formu yeniden oluşturur ve bu form birikir. Ardından endotelde tiyazin alımı çalışmalarında bu süreci belirli noktalarda kesintiye uğratmaya çalışarak sınadılar.

İlk araç, hücreye giremeyen bir elektron alıcısı olan ferrisiyanürdü. Yüzey enzimleri hücre dışında mavi boyayı renksiz formuna indirgediğinde ferrisiyanür bu elektronları geri alabilir ve boya membrandan geçmeden önce ortamda yeniden mavi boyayı oluşturabilir. Ferrisiyanür fazlalığı korunduğu sürece (10 mikromolar boyaya karşı 50 ila 500 mikromolar ferrisiyanür), boya alımı neredeyse durdu; alım ancak ferrisiyanür tükendikten sonra normal hızına döndü. Kinetik veriler aynı durumu başka bir açıdan da gösteriyordu. Ferrisiyanür, yeniden kullanılabilen bir aracı molekülü besleyen kararlı bir yüzey indirgenme akışıyla uyumlu olarak, yaklaşık sabit bir hızda azalıyordu. Hücre dışındaki boya ise havuzu boşaldıkça üstel olarak azalıyordu. Sabit bir akış ile boşalan bir havuzun birlikte görülmesi, ferrisiyanür sinyalinin çözeltiden ayrılan boya moleküllerini değil, sürekli indirgenmeyi yansıttığı anlamına gelir.

İkinci araç, membrandan geçiş adımını tamamen ortadan kaldırdı. Araştırma grubu, yakın bir tiyazin türevi olan toluidin mavisi O'yu, her iki oksidasyon durumunda da hücreye giremeyecek kadar büyük bir poliakrilamid zincirine bağladı. Hücreler, zincire bağlı boyayı yine de indirgedi. Dolayısıyla indirgenme için hücre içine erişim gerekmiyordu. Bu işlemi yürüten sistem yüzeyde bulunuyordu ya da yüzeyle elektriksel olarak bağlantılıydı.

Ardından makaleye başlığını veren ayrım ortaya çıktı. 2 milimolar siyanür ve azit, boya birikimini güçlü biçimde baskıladı; mikroskop altında, normalde çekirdeği çevreleyen koyu mavi ve mor inklüzyonlar neredeyse tamamen kayboldu. Ancak iki inhibitörden hiçbiri hücre dışındaki indirgenmeyi yavaşlatmadı: ferrisiyanür döngüsü azalmadan sürdü ve membrandan geçemeyen polimer hâlâ indirgeniyordu. Engellenen basamak, sürecin daha sonraki bir aşamasındaydı. Siyanür ve azit, yüzeydeki indirgenmeyi değil, hücre içindeki yeniden oksitlenmeyi ve tutulmayı durduruyordu. Hücre canlılığı kontrolleri de bu yorumu destekledi; hücreler bu işlemler sırasında sitozolik belirteç enzimleri olan laktat dehidrogenazı içeride tutmuştu. Dolayısıyla alımın kaybolması yalnızca zehirlenme ya da membran yırtılmasından kaynaklanmıyordu.

Makaledeki bir uyarı hâlâ geçerlidir. Mavi inklüzyonlar çekirdeğin içinde değil, çevresindeydi; bu, hücre içi organellerde oksitlenmeyle uyumluydu, ancak çalışma hangi organellerin söz konusu olduğunu belirlememişti. Diğer hücre tiplerindeki benzer örüntüler, zayıf kanıtlara dayanılarak lizozomal olarak adlandırılmıştı. Tutulmayı gösterilmiş bir olgu, gerçekleştiği yeri ise henüz kesinleşmemiş kabul edin. Elektronların bundan sonra nereye gittiğini izlemek isteyen okuyucular, mitokondriyal elektron taşınması ve redoks süreçleri ile daha geniş bir çerçeve sunan uygulama yoluna göre emilim ve dağılım yazılarına geçebilir.

Boyanma, maruziyet değildir

Üçüncü bir çalışma, bu alım mekanizması biyolojik bir ölçümle birlikte değerlendirildiğinde ne olduğunu gösterir. Scott ve çalışma arkadaşları, halka biçimli bir şeker torusu olan metil beta siklodekstrinin metilen mavisine doğrudan bağlandığını buldu. İnklüzyon kompleksinin birleşme sabiti yaklaşık 310 molar başınayken, boyanın dimerleşmesi için bu değer yaklaşık 5846 molar başınaydı. L929 fibroblastlarında bu bağlanma, hem hücre boyanmasını hem de glukoz alımının uyarılmasını engelledi: siklodekstrinle ön inkübasyon mavi boyanmayı önledi, sonradan eklenmesi ise boyanın hücrelerden uzaklaşmasını hızlandırdı. Optik mavi sinyal hücrelerden kayboldukça, artmış glukoz taşınması da buna sıkı biçimde paralel olarak azaldı.

Yazarlar bu korelasyonu, uzun süreli bir oksidatif stres mekanizmasından ziyade, boya ile glukoz taşıyıcısının aktivasyon yolundaki bir protein arasında doğrudan etkileşim olduğu görüşünü destekleyen bir bulgu olarak yorumladı. Bu çıkarım makuldür, ancak sınırları vardır. Deney proteinin kimliğini belirlemez, taşıyıcının kendisine bağlanmayı göstermez ve boyanmanın kaybolması ile etkinin kaybı arasındaki korelasyon, redoks aracılı tüm yolları dışlayamaz.

Buradan çıkarılacak kalıcı ders ölçümle ilgilidir. Optik boyanma, görünür, oksitlenmiş ve hücreyle ilişkili boyayı gösterir. Renksiz indirgenmiş havuzu tamamen gözden kaçırır; dolayısıyla soluk bir hücre hâlâ boya eşdeğerleri içerebilir. Yoğun boyanmış bir hücre ise toplam doku maruziyetini ya da etkinin büyüklüğünü değil, tutulmuş oksitlenmiş boyayı gösterir. Aynı uyarı daha geniş ölçekte de geçerlidir: farklı hücre tiplerindeki boyanmayı karşılaştırmak ya da koyu bir doku kesitini daha yüksek maruziyetin kanıtı saymak, kaptaki hücrelere bakarken yapılan ilk hatayı tekrarlar. Hücreye alım; indirgenme, difüzyon ve yeniden oksitlenmeden oluşan bir döngüdür. Mavi formun tek bir anlık görüntüsü, bu döngünün yalnızca bir bölümünü gösterir. Laboratuvarda boyama ve boyayla çalışma açısından ve doz ile maruziyet iddialarını yorumlarken ortaya çıkan pratik sonuçlar doğrudan buradan kaynaklanır.