Makale
Metilen mavisiyle boyama: mikroskopi yöntemleri ve gerçek görüntülerden oluşan bir atlas
Metilen mavisiyle boyama, aydınlık alan mikroskopisinde normalde silik görünen hücresel özelliklerin daha kolay ayırt edilmesini sağlar. Öğrencilerin bir yanak hücresinin çekirdeğini bulmasına veya mikroorganizmaların dış hatlarını ve dizilişini incelemesine yardımcı olabilir. Ancak mavi bir nesne, bir gözlemdir. Organizmayı adlandırmak, ölçmek ve hastalığa işaret edip etmediğine karar vermek ayrı işlemlerdir.
Kapak görseli kontrast ilkesini gösterir. Aşağıdaki atlas, birbirinden bağımsız olarak belgelenmiş örneklerin gerçek fotoğraflarını özgün kaynak bilgileriyle birlikte içerir.
Metilen mavisi neleri görünür kılar?
Metilen mavisi bazik bir boyadır: renkli iyonu pozitif yük taşır. OpenStax'ın mikroskobik örneklerin boyanmasını ele alan bölümünde açıkladığı gibi, bazik boyalar negatif yüklü hücresel materyalle etkileşime girer ve hücrelerin daha açık renkli bir arka planda belirginleşmesini sağlayabilir. Uygun preparatlarda metilen mavisi, nükleik asit bakımından zengin bölgeleri ve boyayı bağlayan diğer yapıları belirginleştirir.
Basit boyamada kontrastı tek bir boya sağlar. Bu nedenle farklı organizmalar aynı organizma olmadıkları hâlde mavi görünebilir. Başlangıçta yararlı olan sorular betimleyicidir: nesneler yuvarlak mı, uzamış mı; tek başlarına mı, kümeler hâlinde mi; eşit biçimde mi boyanmışlar, yoksa içlerinde farklılaşan bölgeler mi var? Rengi bir sınıflandırma sonucu olarak yorumlamadan önce basit boyama ile Gram boyama arasındaki farkı inceleyin.
Kontrast ve çözünürlük farklıdır. Kontrast, bir nesneyi çevresinden ayırt etmeye yardımcı olur; çözünürlük ise birbirine yakın ayrıntıları birbirinden ayırır. Daha koyu bir görüntü, daha fazla yapının ayrı ayrı seçilebildiğini garanti etmez. Her koyu granüle organel adı vermek de doğru değildir.
Doğal preparatlar, boyalı yaş preparatlar ve yaymalar
Boyasız, yani doğal bir yaş preparat, boya eklenmeden gözlem yapılmasını sağlar; ancak örneğin özgün ortamından çıkarılması yine de onu değiştirir. Boyalı yaş preparatta, materyal lamelin altında sıvı içinde kalırken reaktif eklenir. Tespit edilmiş bir yaymada materyal bir lam üzerine yayılır ve sonraki işlemlerden önce belirtilen bir tespit yöntemi uygulanır. OpenStax'ın preparat hazırlamaya ilişkin genel açıklaması, yaş preparatları tespit işleminden ayırır ve tespit edilmiş organizmalarda normal hareketin veya metabolizmanın neden artık gözlemlenemediğini açıklar.
Bu preparatlar farklı sorulara yanıt verir:
| Preparat | Yararlı gözlem | Görüntünün tek başına ortaya koyamayacağı bilgi |
|---|---|---|
| Doğal yaş preparat | Hareket, dış hatlar, doğal olarak görünür materyal | Yalnızca hareketten veya biçimden organizmanın kimliği |
| Boyalı yaş preparat | Boyayı bağlayan yapılar ile çevreleri arasındaki kontrast | Reaktifin normal fizyolojiyi değiştirmeden bırakıp bırakmadığı |
| Tespit edilmiş, boyalı yayma | Tanımlanmış bir hazırlama işleminden sonra korunan morfoloji | Özgün canlı örneğin nasıl davrandığı |
| Adı belirtilmiş diferansiyel yöntem | Uygun kontrollerle birlikte belirli bir boyanma reaksiyonu | Yöntemin diğer kanıtları olmadan tür kimliği veya tanı |
Sınıfta karşılaştırma yapmak için, öğretim protokolüne göre ayrı olarak hazırlanmış boyalı bir preparatı incelemeden önce boyasız preparatı kaydedin. Aydınlatma ve görüntü yakalama ayarlarını karşılaştırılabilir tutun. İki farklı hücre fotoğraflanmışsa bunları tek bir hücrenin önceki ve sonraki hâlinin kaydı olarak değil, örnekler olarak tanımlayın.
Mikroskopi atlası: üç gerçek boyalı örnek
Bu atlas, açık lisanslı üç mikrografın özgün bir seçimini ve yorumunu sunar. Kaynakların yazarları, örnekleri ve boyaları belirtmiştir. Örneklerin doğruluğunu bağımsız olarak teyit etmedik. Görüntüler, herhangi bir özellik eklenmeden veya renk değişikliği yapılmadan, kırpılmamış ve kayıpsız WebP dönüşümleri olarak yeniden yayımlanmıştır.
Levha 1: insan yanak hücreleri
Örnek: insan yanak hücreleri. Boya: metilen mavisi. Büyütme: fotoğrafçının bildirdiğine göre 400×. Ölçek çubuğu: mevcut değil; kaynak, kalibre edilmiş piksel boyutu sağlamıyor. Fritzmann2002 tarafından 2017 yılında çekilen fotoğraf, İnsan Yanak Hücreleri (Metilen Mavisiyle Boyama) kaynağından alınmıştır ve CC BY-SA 4.0 lisanslıdır. Bu yeniden yayımlanan görüntü aynı lisansı korur.
.jpg){kind=link}
Tek başına duran bir hücreyle başlayın: daha koyu çekirdeğini çevresindeki mavi sitoplazmadan ayırt etmek daha kolaydır. Ardından altındaki üst üste binen hücreleri inceleyin. Üst üste binme, bir sınırı takip etmeyi zorlaştırır ve belirli bir bölgede daha koyu bir alan oluşturabilir. Bu levhayı, her koyu lekeyi çekirdek olarak saymak için değil, dış hatları takip etme alıştırması için kullanın. Yanak hücresi gözlem rehberi bu örneğe özgü alıştırmayı ayrıntılandırır.
Levha 2: soğan hücreleri
Örnek: kaynağın tanımlamasına göre soğan hücreleri. Boya: metilen mavisi. Büyütme: özgün dosya adında “200x” yer alıyor; bağımsız olarak doğrulanmamıştır. Ölçek çubuğu: mevcut değil; kalibrasyon bilgisi sağlanmıyor. Alvy16 tarafından 2019 yılında çekilen fotoğraf, Soğan hücresi 200x kaynağından alınmıştır ve CC BY 4.0 lisanslıdır.
Uzamış bölmeler düzenli bir tabaka oluşturur. Uzun ortak sınırlarını Levha 1'deki düzensiz dış hatlarla karşılaştırın. Belirgin koyu materyale ve görüş alanının eşit olmayan parlaklığına da dikkat edin. Fotoğraf, her koyu birikintinin ne olduğunu ortaya koymaz. Yararlı bir gözlem kaydında neden renk alan her şeye bir ad vermek yerine artefaktların ve belirsizliğin de yer alması gerektiğini gösterir.
Levha 3: kaynakta Candida spp. olarak tanımlanan maya
Örnek: fotoğrafçıya göre Candida spp. Boya: metilen mavisiyle basit pozitif boyama. Büyütme: mevcut değil. Ölçek çubuğu: mevcut değil; kalibre edilmiş piksel boyutu sağlanmıyor. Wikimedia kullanıcısı Martunia.g olan Marta tarafından 2021 yılında çekilen fotoğraf, Metilen mavisiyle pozitif boyama 2 kaynağından alınmıştır ve CC BY 4.0 lisanslıdır.
Yoğun mavi kümeleri, daha seyrek kenar bölgeleriyle karşılaştırın. Nesnelerin daha az üst üste bindiği yerlerde tek tek dış hatları takip etmek daha kolaydır. Candida adı, bu fotoğraf üzerinden yapılan bir tür tanımlamasından değil, kaynak kaydından gelir. Bu levha ayrıca canlılığa ilişkin bir sonuç da sunmaz. Maya canlılığı ve solunum deneyleri kendilerine özgü koşullar, kontroller ve yorumlama gerektirir.
Ölçeği doğru okumak
Bu levhalar görsel karşılaştırmayı destekler; mikrometre cinsinden ölçüm yapmayı veya levhalar arasında mutlak hücre boyutlarını karşılaştırmayı desteklemez. Bildirilen büyütme, eksik kamera kalibrasyonunun yerini tutmaz. Bir görüntünün ekrandaki boyutunu değiştirmek, görünürdeki büyütmesini değiştirir.
Kendi görüntüleriniz için bilinen bir standart ve ilgili optik düzenekle ölçüm kalibrasyonu yapın. Nikon'un mikrometri rehberi, bir lam mikrometresinin görüntüdeki veya retiküldeki keyfî bölmeleri fiziksel uzunluklara nasıl dönüştürdüğünü açıklar. Objektifi, kamera yapılandırmasını ve kalibrasyonu kaydedin; bu verilerden bir ölçek çubuğu ekleyin. Bir ders kitabındaki ortalama hücre boyutundan hareketle ölçek çubuğu oluşturmayın.
Şişedeki ürün yönteme uygun mu?
Üzerinde metilen mavisi yazan bir şişe, eksiksiz bir laboratuvar spesifikasyonu değildir. Konsantrasyonunu ve birimlerini, çözücüsünü, ek bileşenlerini, amaçlanan uygulamasını, parti belgelerini ve talimatlarını kontrol edin. Bir reaktifin güvenlik bilgi formu tehlikeleri açıklar; yöntem talimatları ise amaçlanan preparat için nasıl kullanılacağını belirler.
Somut bir örnek, Merck'in Löffler metilen mavisi çözeltisidir. Üretici bunu bir mikroskopi reaktifi olarak tanımlar ve aside dirençli boyamada karşıt boya olarak kullanımını açıklar. Belirtilen yanıcılığı da, kullanım veya ısıtma planlanırken “mavi bir sıvı” bilgisinin neden yetersiz olduğunu gösterir. Bu özellikler söz konusu formülasyona aittir; her sulu metilen mavisi çözeltisi için otomatik olarak geçerli değildir.
Benzer şekilde, eozin metilen mavisi agar belirli bir formülasyona sahip kültür besiyeridir. Bir örneğe yalnızca metilen mavisi eklenerek hazırlanan bir lam boyası değildir. Farklı bir görüntüleme amacı için mikroskopide metilen mavisine alternatifleri karşılaştırın.
Başlangıç düzeyindeki bir mikroskop setinde, setin belgelenmiş eğitim yöntemi, içeriği bilinen hazır preparatları ve belirtilen reaktifiyle başlayın. Bir şişenin etiketi kaybolmuşsa veya bileşimi belirlenemiyorsa onu uygun, belgelenmiş reaktifle değiştirin. Göz koruması kullanın ve kullanılan formülasyon için sağlanan kullanım talimatlarına uyun. İnsan kaynaklı materyal ve bilinmeyen çevresel örnekler, eğitim laboratuvarının örnek işleme ve bertaraf prosedürlerini gerektirir; boyama bu prosedürlerin yerine geçmez.
Sonuçtan önce gözlemi yazın
“Kümeler hâlinde mavi oval nesneler”, bir görüntünün savunulabilir bir betimlemesidir. “Belirli bir enfeksiyon” ifadesi ise görüntünün sağlamadığı kanıtları gerektirir. Laboratuvar defterinde örneğin kaynağını, preparatın hazırlanmasını, boyanma reaksiyonunu ve tanımlama yöntemini ayrı ayrı kaydedin. Bu ayrım, basit bir sınıf görüntüsünü yararlı kılar ve dikkat çekici bir mikrografın destekleyemeyeceği bir iddiaya dayanak olarak kullanılmasını önler.