Mga eksperimentong nag-ugnay sa methylene blue at respirasyong selular

Ang dugo ng tao na inalisan ng fibrin at pinainit sa 37 °C sa loob ng tatlong oras ay kumokonsumo ng humigit-kumulang dalawang porsiyento ng oksihenong taglay nito. Magdagdag ng kaunting methylene blue bago ang inkubasyon, at ang parehong dugo ay kumokonsumo ng humigit-kumulang animnapu't limang porsiyento. Walang nagbago sa mga selula. Ang solusyon lamang ang nagbago.

Nagmula ang bilang na iyon sa isang papel noong 1928 nina George Harrop at E. S. Guzman Barron sa Johns Hopkins, at dito nag-ugat ang madalas uliting pahayag na pinapahusay ng methylene blue ang respirasyong selular. Hindi mali ang pahayag, ngunit mas limitado ang saklaw nito kaysa sa ipinahihiwatig nito.

Ano talaga ang sinusukat ng bilang sa talahanayan

Ang pangunahing sukatan ay ang pagkuha ng oksiheno, na tinukoy sa pamamagitan ng pagsusuri ng gas. Sinala nina Harrop at Barron ang bagong kuhang dugo sa bulak sa 10 °C upang alisin ang mga puting selula, pinuspos ng oksiheno ang sampol, hinati ito, nilagyan ng tina ang isang bahagi, at sinuri ang dalawa pagkatapos ng inkubasyon. Bihirang lumampas sa humigit-kumulang isang libo bawat kubikong milimetro ang bilang ng mga leukocyte. Iniulat ang pagkonsumo ng oksiheno bilang bahagi ng paunang nilalamang oksiheno ng sampol na nawala.

Sinukat din nila ang carbon dioxide, at dito naging mahirap ang pamamaraan. Ang dugong inalisan ng fibrin ay naglabas ng hanggang dalawang millimole ng carbon dioxide bawat 100 mL sa unang oras ng inkubasyon dahil sa mga dahilan na walang kaugnayan sa reaksiyong pinag-aaralan, kaya hindi magagamit ang mga respiratory quotient mula sa buong dugo. Ang mga hinugasang selula lamang sa solusyon ni Locke ang nagbigay ng mga bilang na maaaring bigyang-kahulugan, at nakapangkat ang mga iyon sa pagitan ng 0.73 at 0.80, mayroon man o walang tina.

Hindi basta maliit na detalye iyon. Ang "respirasyon" sa mga papel na ito ay nangangahulugan ng palitan ng gas sa loob ng isang saradong sisidlan. Hiwalay na sinusuri ang agwat sa pagitan ng pagkonsumo ng oksiheno at kapaki-pakinabang na enerhiyang nalilikha sa kung ano ang sinasabi at hindi sinasabi ng pagkonsumo ng oksiheno tungkol sa ATP.

Pinakamalaki ang idinagdag ng tina kung saan pinakamababa ang respirasyon ng mga selula

Halos walang masusukat na pagkonsumo ng oksiheno ang mga ganap nang hinog na erythrocyte ng mamalya. Mayroon naman nito ang mga erythrocyte ng ibon na may nukleo. Sinubukan nina Harrop at Barron ang dalawa, at ang pagkakaibang ito ang pangunahing batayan ng kanilang argumento.

Sa mga sampol mula sa mamalya, nagdulot ang tina ng pagtaas nang dalawampu hanggang limampung ulit. Sa dugo ng gansa, na ang mga selula ay nagsasagawa na ng respirasyon, hindi nito kailanman napataas ang bilis nang higit sa doble. Habang mas mataas ang paunang respirasyon, mas kaunti ang maidaragdag ng tina.

Makikita rin ang parehong pagkakaiba-iba sa loob ng isang espesye. Ang isang sampol ng dugo ng tao mula sa pasyenteng may polycythemia vera, na naglalaman ng mga hindi pa hinog na selula, ay kumonsumo ng 11.3 porsiyento ng oksiheno nito nang walang tina, kumpara sa 2.8 porsiyento para sa mga hinugasang selula mula sa isang malusog na donor. Itinaas lamang ito ng tina sa 63.4 porsiyento, isang pagbilis nang anim na ulit samantalang halos tatlumpung ulit ang pagbilis sa mga normal na selula. Itinulak ng tina ang mga hinog na selula tungo sa asal ng mga hindi pa hinog na selula, na siyang sinabi ng mga may-akda na ginagawa nito.

Dapat sana itong napigil ng cyanide

Alam nang pinipigil ng cyanide ang oksidasyong selular. Idinagdag pa rin ito nina Harrop at Barron, kasabay ng tina.

Kinakatawan ng mga resulta sa dugo ng baka ang pangkalahatang nakita. Bumaba ang nilalamang oksiheno mula 22.61 tungo sa 22.03 porsiyento ayon sa bolyum sa loob ng tatlong oras nang walang anumang idinagdag. Sa methylene blue, bumaba ito sa 12.84. Sa methylene blue at potassium cyanide na may konsentrasyong isang ikalimang-libo ng isang molar, bumaba ito sa 12.74. Halos hindi naapektuhan ang epekto ng tina.

Larawan: isang tuloy-tuloy na tala ng mikrorespirasyon ng mga erythrocyte ng tao. Minamarkahan ng palaso ang pagdaragdag ng methylene blue. Bago nito, halos patag ang guhit; pagkatapos, tuloy-tuloy itong umaakyat. Muling inilathala mula kina Harrop at Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Ang kanilang konklusyon ay kumilos ang tina bilang tagapagdala ng oksiheno, "nagbibigay ng isang sangkap na nawala na sa mga erythrocyte na walang nukleo ng nasa hustong gulang na mga mamalya." Makalipas ang dalawang taon, inilatag nina Michaelis at Salomon sa Rockefeller Institute ang hindi pagkakasundo sa anyong nananatili hanggang ngayon. Alinman sa ang epekto ng tina ay "isang nagkataon lamang na katangian ng tina," o ang tina ay "isang modelo para sa ilang hindi pa kilalang sangkap sa mga organismo." Hindi pa nareresolba ang dalawang posibilidad na iyon. Ang nagbago ay maaari nang ilarawan nang mas tiyak ang mga selula.

Ganoon din ang ginawa ng isang katas ng atay

Ipinakita nina Michaelis at Salomon na ang mga katas ng mga organo na ginawa gamit ang malamig na tubig ay nagdudulot ng parehong pagpapasigla. Pinakamalakas ang atay ng daga, kasunod ang bato, pali, at bayag. Kaunti o walang epekto ang utak, kalamnan, at suwero ng dugo.

Pagkatapos ay sinubukan nila ang katas sa presensiya ng carbon monoxide. Hindi nagbago ang respirasyong dulot ng katas o ng tina sa isang halong 98 porsiyentong carbon monoxide at 2 porsiyentong oksiheno. Pinigilan ng parehong halong gas ang respirasyon ng lebadura at ng mga erythrocyte ng manok na may nukleo nang humigit-kumulang 60 hanggang 80 porsiyento, alinsunod sa paglalarawan ni Warburg sa isang fermento ng respirasyon na sensitibo sa carbon monoxide. Samakatuwid, hindi ang ensima ni Warburg ang hindi pa natutukoy na sangkap ng tisyu.

Ilang posibleng pagkakakilanlan ang naalis sa proseso. Ang glutathione sa reduktadong anyo at cysteine ay nagdulot lamang ng pagkonsumo ng oksihenong kailangan para sa sarili nilang oksidasyon. Inalis bilang posibilidad ang koensima nina Harden at Young dahil nasa kalamnan ang pinakamalaking dami nito ngunit halos pinakamaliit ang ipinakitang epekto. Naharap sa parehong salungatan ang cytochrome ni Keilin, na pinangalanan ilang taon bago nito. Tinawag nilang mungkahi lamang ang sarili nilang ideya na nagmula sa nukleo ng selula ang aktibong sangkap.

May mga kondisyong kailangan para sa epekto

Kailangang buo ang mga selula. Ang hemolisis na dulot ng destiladong tubig o paulit-ulit na pagyeyelo ay tuluyang nag-alis ng tugon sa tina at sa katas, at binawasan naman ito ng bahagyang hemolisis nang proporsiyonal.

Kailangan din ang asukal. Sinuportahan ng glucose, fructose, at sucrose ang respirasyong dulot ng tina; hindi ito ginawa ng mannitol. Kapag walang asukal, walang respirasyon, at tila napinsala ng tina ang mga selula sa proseso, kaya hindi ito naibalik ng glucose na idinagdag makalipas ang isa o dalawang oras. Iminungkahi ng mga may-akda na ino-oxidize ng tina ang isang sangkap ng estruktura na kailangan ng selula.

Malaki ang itinaas ng epekto ng tina kapag naiilawan, bagaman malinaw ang epekto kahit sa dilim. Iba-iba ang asal ng ibang mga tinang maaaring sumailalim sa reduksiyon: pumantay o lumampas ang toluylene blue sa methylene blue, samantalang halos walang ginawa ang indigo disulfonate. Walang malinaw na ugnayang lumitaw sa pagitan ng potensiyal ng oksidasyon-reduksiyon ng isang tina at ng laki ng epekto nito, na iniugnay ng mga may-akda sa kakayahan nitong makatawid sa lamad at sa toksisidad.

Sumabay ang epekto sa fermentasyon, hindi sa respirasyon

Lumipat ang pag-aaral ni Barron noong 1930 mula sa mga suspensiyon ng selula tungo sa mga hiwa ng tisyu mula sa mga normal na organo ng daga at mga inilipat na tumor.

Sa mga tisyu na walang aerobikong glikolisis, walang ginawa ang methylene blue o bahagya nitong pinababa ang pagkonsumo ng oksiheno: sa bato nang humigit-kumulang 14 porsiyento, sa lapay nang humigit-kumulang 14 porsiyento, at sa atay nang humigit-kumulang 5 porsiyento. Sa mga tisyu na nagsasagawa ng fermentasyon sa presensiya ng oksiheno, pinataas nito ang pagkonsumo: sa pali nang humigit-kumulang 8 porsiyento, at sa utak nang humigit-kumulang 13 porsiyento. Ang pagtaas sa mga tumor ay mula sa humigit-kumulang 27 porsiyento sa isang carcinoma sa suso ng tao hanggang sa higit 80 porsiyento sa isang Rous sarcoma ng manok, na humigit-kumulang proporsiyonal sa aerobikong glikolisis ng bawat tisyu.

Larawan: bawat puntos ay isang uri ng tisyu. Ang pahalang na aksis ay aerobikong glikolisis; ang patayong aksis ay ang pagbabago sa pagkonsumo ng oksiheno pagkatapos ng methylene blue. Datos mula kay Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Talahanayan 6, PMID 19869777.

Pagkatapos, nagbigay ng kabaligtarang larawan ang eksperimento sa cyanide. Nang harangin ng cyanide ang respirasyon sa mga tisyu na dati ay hindi tumutugon at naging lantad ang fermentasyon, muli nang pinataas ng tina ang pagkonsumo ng oksiheno: sa bato nang humigit-kumulang 59 porsiyento, sa atay nang humigit-kumulang 19 porsiyento, sa pali nang humigit-kumulang 286 porsiyento, at sa bayag nang humigit-kumulang 200 porsiyento.

Iminungkahi ni Barron na maaaring magsilbing pagsusuri ang tina para sa kakayahan ng isang selula o tisyu na magsagawa ng fermentasyon, at nagtapos siya sa isang haka-haka: ang sunod-sunod na mga henerasyon ng tumor na pinalaki sa midyum na may tina ay maaaring balang araw gawing permanenteng katulad ng sa normal na tisyu ang metabolismo ng isang tumor. Isa iyong tanong sa pananaliksik na isinulat noong 1930. Hindi iyon isang pahayag tungkol sa paggamot.

Ano ang hindi maaaring nasukat ng mga eksperimento

Noong 1928 at 1930, ang "respirasyon" ay nangangahulugang pagkonsumo ng oksiheno. Unang iniulat ang adenosine triphosphate noong 1929, at noong 1949 lamang naipakita na ang mga nakahiwalay na mitochondria ay bumubuo ng mga ester ng phosphate habang naglilipat ng mga elektron. Walang alinman sa mga unang papel tungkol sa methylene blue ang maaaring nakasukat ng produksiyon ng enerhiya, at wala rin sa mga ito ang nag-angking nagawa iyon.

Ang mga selula ang ikalawang problema. Walang mitochondria ang mga ganap nang hinog na erythrocyte ng mamalya. Sa yugto ng reticulocyte, inaalis nila ang mitochondria at ribosome sa pamamagitan ng selektibong autophagy, kaya umaasa sa glikolisis ang isang hinog na pulang selula at pangunahing ginagamit nito ang landas ng pentose phosphate para sa NADPH sa halip na ATP. Sa mga eksperimento noong 1928, walang kadena ng transportasyon ng elektron na maaaring kumpunihin. Anuman ang kumonsumo ng oksiheno ay may ibang ginagawa.

Medyo malinaw na ngayon ang paglalarawan sa ibang prosesong iyon. Tumatanggap ang methylene blue ng mga elektron mula sa mga reducing equivalent ng selula at nagiging leucomethylene blue, na muling ino-oxidize ng molekular na oksiheno, kaya nakukumpleto ang siklo. Sa mga pulang selula ng tao, ang flavin reductase na umaasa sa NADPH at mga kaugnay na disulfide reductase ang nagsasagawa ng hakbang ng reduksiyon. Natuklasan ng isang pag-aaral noong 1976 na gumamit ng glucose na may panandang masusubaybayan na pinasisigla ng tina ang landas ng hexose monophosphate, na umaasa sa oxyhemoglobin ang epekto sa mababang konsentrasyon, at na nakalikha ng hydrogen peroxide ang mas mataas na konsentrasyon na 0.1 mM. Kapag nakatagpo ng oksiheno ang tinang nasa reduktadong anyo, peroxide ang nalilikha, hindi mga bigkis ng phosphate.

Sa mitochondria, mas pinagtatalunan ang larawan kaysa sa inaamin ng mga popular na buod. Ayon sa isang hanay ng mga pag-aaral, kumukuha ang tina ng mga elektron mula sa bahagi ng complex I at ipinapasa ang mga ito sa cytochrome c. Natuklasan naman ng isa pa na sa mitochondria ng utak ng daga, hindi nito maibabalik ang respirasyon pagkatapos ng pagharang ng antimycin, at sa halip ay inilagay ang tumatanggap ng elektron sa lugar ng pagbubuklod ng ubiquinol sa complex III. Natuklasan ng ikatlo na pinataas ng mabababang konsentrasyon ang pagkonsumo ng oksiheno sa pahingang estado habang hindi binabago ang respirasyong pinasigla ng ADP. Ang pinakadirektang pahayag ng punto ay hindi umaasa sa oksidatibong posporilasyon ang pagkonsumo ng oksihenong dulot ng methylene blue: nagpatuloy ito nang pigilan ang kadena ng respirasyon, at sa mga preparasyong walang ganitong kadena.

Mayroon ding mga direktang sukat ng agwat sa pagitan ng dalawang dami. Sa mga nakahiwalay na mitochondria ng atay ng daga, ang pagtaas ng konsentrasyon ng tina ay nagpababa sa mga ratio ng kontrol ng respirasyon at nagdulot ng pamamaga, na inilarawan ng mga may-akda bilang pagkakahiwalay ng oksidasyon at posporilasyon. Sa atay ng daga na pinadaluyan ng likido, pinataas ng methylene blue ang pagkonsumo ng oksiheno habang bumaba ang ratio ng ATP sa ADP.

Pareho ang mensahe ng mga klinikal na tala. Ginagamot ang methemoglobinemia gamit ang humigit-kumulang isa hanggang dalawang milligram ng methylene blue bawat kilogram na ibinibigay sa ugat, sa pamamagitan ng isang landas ng reduksiyon na umaasa sa NADPH, at nagdudulot naman ng mismong kondisyong ginagamot ang mas malalaking dosis. Binabanggit ng parehong pagsusuri na pinakamalaki ang epekto bilang antidoto sa mga buo pang erythrocyte at nababawasan kapag may hemolisis, na siyang natuklasan tungkol sa hemolisis noong 1930 na muling lumitaw makalipas ang pitumpu't tatlong taon sa konteksto ng ospital. Ang isang tambalan na ang kapaki-pakinabang at nakapipinsalang mga epekto ay nasa magkasalungat na panig ng isang hangganan ng dosis ay hindi isang tambalan na ang dosis ay dapat ibatay sa sukat ng pagkonsumo ng oksiheno.

Bakit bahagi ng talakayan ang batch

May napansin sina Harrop at Barron na karapat-dapat basahin muli. Ang methylene blue mismo ay lumilikha ng isang banda sa spectroscope sa pagitan ng dalawang natatanging banda ng methemoglobin, "na madaling magdulot ng pagkalito sa isang pahapyaw na pagsusuri." Maaaring gayahin ng tina ang sangkap na hinahanap.

May kemikal ding anyo ang parehong problema. Ang isang kaugnay na phenothiazine na naroroon bilang maliit na bahagi ay may sarili nitong asal sa redox, kakayahang makatawid sa lamad, at toksisidad. Isang dokumentadong kaso ang nagpapakita ng konkretong kahalagahan nito: sa isang pag-aaral ng paglalagay ng iodine sa methylene blue, ang mga sampol na naglalaman ng humigit-kumulang 7 hanggang 8 porsiyentong Azure B ay pangunahing nagbunga ng Azure B na nalagyan ng iodine, kaya ang impurity, sa halip na ang methylene blue, ang nangibabaw sa reaksiyon.

Sinumang gumagamit ng methylene blue bilang reagent, sa isang laboratoryo, sa isang mesa para sa paglamlam, o sa isang akwaryum, ay gumagamit ng sangkap na hindi pa natutukoy nang sapat maliban kung nasuri na ang mga katangian ng batch. Bahagi ng eksperimento ang mga kaugnay na sangkap, pagkakakilanlan, mga elemental na impurity, natitirang solvent, at nalalabi matapos ang pagsunog, sa halip na mga papeles lamang na nakapalibot dito. Kinukuha ng Blupreme ang methylene blue nito mula sa isang tagagawang parmasyutiko at naglalathala ng kumpletong sertipiko ng pagsusuri, na sumusubok sa buong espesipikasyon ng USP sa halip na sa mabibigat na metal lamang; tinatalakay sa gabay sa pagbasa ng sertipiko ng pagsusuri at kung ano ang pinatutunayan at hindi pinatutunayan ng pagtatalagang USP-grade kung paano suriin ang dokumento kaugnay ng ipinapahayag.

Tama ang bilang

Maingat ang mga eksperimento noong 1928 at 1930, at nananatiling wasto ang kanilang pangunahing obserbasyon: maaaring magpakonsumo ng oksiheno ang isang tinang maaaring sumailalim sa reduksiyon sa isang selulang halos hindi nagsasagawa ng respirasyon, nang maraming ulit sa bilis nito sa pahingang estado, nang hindi dumaraan sa hakbang na hinaharang ng cyanide.

Lumilitaw ang pagkakamali sa kalaunan, kapag binabasa ang "respirasyon" ayon sa makabagong kahulugan nito. Sinasabi ng sukat ng palitan ng gas na nakarating sa oksiheno ang mga elektron. Hindi nito sinasabing ginamit ang alinman sa mga ito upang gumawa ng ATP, at sa isang selulang walang mitochondria, sukdulan ang agwat sa pagitan ng dalawang pahayag na iyon. Inilalagay ng mas malawak na mapa ng ginagawa ng methylene blue sa mga selula ang parehong pagkakaiba sa isang mas malawak na konteksto, at ipinapaliwanag ng kasaysayan ng tambalan mula sa tina hanggang sa gamot kung paano napunta sa mga eksperimentong ito ang isang pangkulay ng tela.