Metilen gögüni öýjük dem alşy bilen baglanyşdyran tejribeler

Fibrini aýrylan adam gany 37 °C temperaturada üç sagat saklananda, düzümindäki kislorodyň takmynan iki göterimini sarp edýär. Inkubasiýadan öň az mukdarda metilen gögi goşulsa, şol bir gan kislorodyň takmynan altmyş bäş göterimini sarp edýär. Öýjüklerde hiç zat üýtgemedi. Diňe ergin üýtgedi.

Bu san Johns Hopkins-de George Harrop bilen E. S. Guzman Barronyň 1928-nji ýylda çap eden makalasyndan gelip çykýar we metilen gögüniň öýjük dem alşyny gowulandyrýandygy baradaky giňden gaýtalanýan pikiriň gözbaşydyr. Bu pikir nädogry däl, ýöne onuň manysy eşidilýäninden has çäklidir.

Tablisadaky san aslynda nämäni ölçeýär

Ölçelen ahyrky görkeziji gaz seljermesi arkaly kesgitlenen kislorodyň siňdirilmegi bolupdyr. Harrop bilen Barron ak gan öýjüklerini aýyrmak üçin täze alnan gany 10 °C temperaturada pagta arkaly süzüpdirler, nusgany kislorod bilen doýrupdyrlar, ony böleklere bölüpdirler, bir bölegine boýag goşupdyrlar we inkubasiýadan soň ikisini hem seljeripdirler. Leýkositleriň sany her kub millimetrde takmynan bir müňden seýrek geçipdir. Kislorodyň sarp edilişi nusganyň başlangyç kislorod mukdarynyň ýiten paýy hökmünde görkezilipdir.

Olar kömürturşy gazyny hem ölçäpdirler, ýöne bu ýerde usul kynçylyk döredipdir. Fibrini aýrylan gan inkubasiýanyň ilkinji sagadynda öwrenilýän reaksiýa bilen baglanyşyksyz sebäplerden her 100 mL üçin iki millimola çenli kömürturşy gazyny bölüp çykarypdyr. Şonuň üçin tutuş gandan alnan dem alyş koeffisiýentlerini ulanmak mümkin bolmandyr. Diňe Locke erginindäki ýuwlan öýjükler düşündirip bolýan görkezijileri beripdir we olar boýagly hem-de boýagsyz ýagdaýda 0.73 bilen 0.80 aralygynda jemlenipdir.

Bu jikme-jiklik ähmiýetsiz däl. Bu makalalarda «dem alyş» ýapyk gapdaky gaz çalşygyny aňladýar. Kislorodyň sarp edilişi bilen peýdaly energiýa öndürilişiniň arasyndaky tapawut kislorodyň sarp edilişiniň ATP barada nämäni aýdýandygy we nämäni aýtmaýandygy baradaky makalada aýratyn seljerilýär.

Öýjükler näçe az dem alsa, boýag şonça köp goşant goşdy

Süýdemdirijileriň ýetişen eritrositlerinde ölçäp boljak kislorod sarp edilişi diýen ýaly ýok. Guşlaryň ýadroly eritrositlerinde bolsa bar. Harrop bilen Barron ikisini hem barlapdyrlar we bu tapawut olaryň deliliniň esasyny düzýär.

Süýdemdirijileriň nusgalarynda boýag kislorodyň sarp edilişini ýigrimi-elli esse artdyrypdyr. Öýjükleri eýýäm dem alýan gaz ganynda bolsa bu tizlik hiç haçan iki esseden köp artmandyr. Başlangyç dem alyş näçe ýokary bolsa, boýagyň goşup biljek täsiri şonça az bolupdyr.

Şol bir kanunalaýyklyk bir görnüşiň içinde hem görünýär. Hakyky polisitemiýaly näsagdan alnan, ýetişmedik öýjükleri öz içine alýan adam ganynyň nusgasy boýagsyz ýagdaýda kislorodynyň 11.3 göterimini sarp edipdir. Sagdyn donordan alnan ýuwlan öýjüklerde bolsa bu görkeziji 2.8 göterim bolupdyr. Boýag ony diňe 63.4 göterime ýetiripdir: adaty öýjüklerde tizlik otuz essä golaý artan bolsa, bu ýerde alty esse artypdyr. Boýag ýetişen öýjükleriň özüni alyp barşyny ýetişmedik öýjükleriňkä ýakynlaşdyrypdyr; awtorlar hem onuň hut şeýledigini aýdypdyrlar.

Sianid muny saklamalydy

Sianidiň öýjük oksidlenmesini saklaýandygy belli bolupdyr. Muňa garamazdan, Harrop bilen Barron ony boýag bilen bilelikde goşupdyrlar.

Sygyr gany bilen alnan netijeler muňa häsiýetli mysaldyr. Hiç zat goşulmadyk ýagdaýda üç sagadyň dowamynda kislorodyň mukdary göwrüm göterimi boýunça 22.61-den 22.03-e düşüpdir. Metilen gögi bilen ol 12.84-e düşüpdir. Metilen gögi we molýarlygy bäş müňden bir bolan kaliý sianidi bilen bolsa 12.74-e düşüpdir. Boýagyň täsiri diýen ýaly üýtgemändir.

Surat: adam eritrositleriniň mikrodem alşynyň üznüksiz ýazgysy. Ok metilen gögüniň goşulan pursadyny görkezýär. Ondan öň çyzyk diýen ýaly tekizdir; soň bolsa yzygiderli ýokarlanýar. Harrop we Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478 çeşmesinden göçürildi.

Olaryň netijesi boýagyň kislorod daşaýjy hökmünde hereket edip, «süýdemdirijileriň ýetişen ýadrosyz eritrositlerinden ýitip giden bir maddany üpjün edýändigi» bolupdyr. Iki ýyl soň Rockefeller institutyndaky Michaelis bilen Salomon bu pikir tapawudyny häzire çenli dowam edýän görnüşde beýan edipdirler. Ýa boýagyň täsiri «boýagyň tötänleýin häsiýetidi», ýa-da boýag «organizmlerdäki näbelli bir maddanyň modelidi». Bu iki çaklamanyň arasyndaky mesele henizem çözülmedi. Üýtgän zat — indi öýjükleri has takyk häsiýetlendirip bolýar.

Bagyr ekstrakty hem şeýle etdi

Michaelis bilen Salomon organlaryň sowuk suw ekstraktlarynyň şol bir güýçlendiriji täsiri döredýändigini görkezipdirler. Alakanyň bagrynyň täsiri iň güýçli bolupdyr, soň böwrek, dalak we tohumlyk gelipdir. Beýniniň, myşsanyň we gan syworotkasynyň täsiri az bolupdyr ýa-da asla bolmandyr.

Soňra olar ekstrakty uglerod monoksidiniň garşysynda barlapdyrlar. Ekstrakt ýa-da boýag arkaly döredilen dem alyş 98 göterim uglerod monoksidi we 2 göterim kislorod garyndysynda üýtgemändir. Şol gaz garyndysy hamyrmaýanyň we guşlaryň ýadroly eritrositleriniň dem alşyny takmynan 60–80 göterim peseldipdir. Bu Warburgyň uglerod monoksidine duýgur dem alyş fermenti baradaky düşündirişi bilen gabat gelipdir. Diýmek, näbelli dokuma maddasy Warburgyň fermenti bolmandyr.

Barlaglaryň dowamynda birnäçe çak edilýän madda aradan aýrylypdyr. Gaýtarylan glutation bilen sistein diňe öz oksidlenmegi üçin zerur bolan kislorodyň sarp edilmegine sebäp bolupdyr. Harden bilen Youngyň koenzimi hem aradan aýrylypdyr, sebäbi ol myşsada iň köp mukdarda bolsa-da, myşsa iň pes diýen ýaly täsir görkezipdir. Birnäçe ýyl öň ady goýlan Keiliniň sitohromy hem şol bir gapma-garşylyga duş gelipdir. Işjeň maddanyň öýjük ýadrosyndan gelip çykýandygy baradaky öz pikirlerini bolsa olar diňe bir çaklama diýip atlandyrypdyrlar.

Täsiriň ýüze çykmagy belli şertlere baglydy

Öýjükler bitewi bolmalydy. Distillirlenen suw ýa-da gaýtalap doňdurmak arkaly döredilen gemoliz boýaga-da, ekstrakta-da bolan jogaby ýok edipdir; bölekleýin gemoliz bolsa ony öz derejesine laýyklykda azaldypdyr.

Şeker hem zerur bolupdyr. Glýukoza, fruktoza we saharoza boýagyň döredýän dem alşyny goldapdyr; mannitol bolsa goldamandyr. Şeker bolmasa, asla dem alyş bolmandyr we bu ýagdaýda boýag öýjüklere zeper ýetirýän ýaly görnüpdir. Şonuň üçin bir ýa-da iki sagat soň goşulan glýukoza dem alşy dikeltmändir. Awtorlar boýagyň öýjüge zerur bolan gurluş bölegini oksidleýändigini çaklapdyrlar.

Ýagtylyk boýagyň täsirini ep-esli artdyrypdyr, ýöne täsir garaňkyda hem aýdyň bolupdyr. Gaýtarylyp bilýän beýleki boýaglar başgaça hereket edipdir: toluilen gögi metilen gögüne deň ýa-da ondan güýçli täsir görkezipdir, indigo disulfonaty bolsa diýen ýaly hiç zat etmändir. Boýagyň oksidlenme-gaýtarylma potensialy bilen onuň täsiriniň ululygynyň arasynda anyk baglanyşyk ýüze çykmandyr. Awtorlar muny membrananyň geçirijiligi we zäherlilik bilen düşündiripdirler.

Täsir dem alyş bilen däl-de, fermentasiýa bilen baglanyşyklydy

Barronyň 1930-njy ýyldaky barlagy öýjük suspenziýalaryndan alakanyň kadaly organlarynyň we göçürilip oturdylan çişleriň dokuma kesimlerine geçipdir.

Aerob glikolizi bolmadyk dokumalarda metilen gögi hiç hili täsir etmändir ýa-da kislorodyň sarp edilişini az-kem peseldipdir: böwrekde takmynan 14 göterim, aşgazanasty mäzde takmynan 14 göterim, bagyrda takmynan 5 göterim. Kislorod bar mahaly fermentasiýa edýän dokumalarda bolsa sarp edilişi artdyrypdyr: dalakda takmynan 8 göterim, beýnide takmynan 13 göterim. Çişlerdäki ösüş adamyň göwüs karsinomasynda takmynan 27 göterimden Rous towuk sarkomasynda 80 göterimden gowraga çenli bolupdyr we her dokumanyň aerob glikolizine takmynan laýyk gelipdir.

Surat: her nokat bir dokuma görnüşini görkezýär. Kese ok aerob glikolizi, dik ok bolsa metilen gögi goşulandan soň kislorodyň sarp edilişindäki üýtgemäni görkezýär. Maglumatlar Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), 6-njy tablisa, PMID 19869777 çeşmesinden alyndy.

Soňra sianid bilen geçirilen tejribe munuň ters görnüşini ýüze çykarypdyr. Öň jogap bermedik şol dokumalarda dem alyş sianid bilen petiklenip, fermentasiýa ýüze çykanda, boýag kislorodyň sarp edilişini ýene artdyrypdyr: böwrekde takmynan 59 göterim, bagyrda takmynan 19 göterim, dalakda takmynan 286 göterim, tohumlykda takmynan 200 göterim.

Barron boýagyň öýjügiň ýa-da dokumanyň fermentasiýa ukybyny barlamak üçin ulanylyp bilinjekdigini teklip edipdir we makalasyny bir çaklama bilen tamamlapdyr: boýagly gurşawda çiş kulturasyny köp nesliň dowamynda ösdürmek bir gün onuň metabolizmini hemişelik ýagdaýda kadaly dokumanyň metabolizmine meňzedip biler. Bu 1930-njy ýylda ýazylan ylmy barlag soragydy. Ol bejergi baradaky tassyklama däl.

Tejribeler nämäni ölçäp bilmezdi

1928-nji we 1930-njy ýyllarda «dem alyş» kislorodyň sarp edilmegini aňladýardy. Adenozin trifosfat barada ilkinji gezek 1929-njy ýylda habar berildi, izolirlenen mitohondriýalaryň elektronlary geçirýän wagty fosfaty esterleşdirýändigi bolsa 1949-njy ýylda görkezildi. Metilen gögi baradaky irki makalalaryň hiç biri energiýa öndürilişini ölçäp bilmezdi we olaryň hiç biri muny edendigini öňe sürmedi.

Ikinji mesele öýjükleriň özleridir. Süýdemdirijileriň ýetişen eritrositlerinde mitohondriýa ýok. Retikulosit döwründe olar saýlama autofagiýa arkaly mitohondriýalary we ribosomalary aýyrýarlar. Şonuň üçin ýetişen gyzyl gan öýjügi glikoliz arkaly işleýär we pentoza-fosfat ýoluna esasan ATP üçin däl-de, NADPH üçin daýanýar. 1928-nji ýyldaky tejribelerde düzedip boljak elektron transport zynjyry ýokdy. Kislorody sarp edýän zat başga bir iş edýärdi.

Şol başga işiň nämedigi häzirki wagtda ýeterlik derejede gowy düşündirilýär. Metilen gögi öýjügiň gaýtaryjy ekwiwalentlerinden elektronlary kabul edip, leýkometilen gögüne öwrülýär. Ol bolsa molekulýar kislorod tarapyndan gaýtadan oksidlenip, aýlawy tamamlaýar. Adamyň gyzyl gan öýjüklerinde gaýtarylma tapgyryny NADPH-a bagly flawin reduktazasy we oňa ýakyn disulfid reduktazalary ýerine ýetirýär. Belliklenen glýukozany ulanan 1976-njy ýyldaky barlag boýagyň geksoza-monofosfat şuntyny işjeňleşdirýändigini, pes konsentrasiýadaky täsiriň oksigemoglobine baglydygyny we has ýokary bolan 0.1 mM konsentrasiýanyň wodorod peroksidini döredýändigini ýüze çykardy. Kislorod bilen duşuşýan gaýtarylan boýag fosfat baglaryny däl-de, peroksid öndürýär.

Mitohondriýalarda ýagdaý giňden ýaýran gysgaça düşündirişleriň boýun alýanyndan has jedellidir. Barlaglaryň bir ugry boýagyň I toplumyň sebitinden elektronlary alyp, olary sitohrom c-ä geçirýändigini öňe sürýär. Başga bir barlag onuň syçanyň beýni mitohondriýalarynda antimisiniň petiklemesinden soň dem alşy dikeldip bilmeýändigini ýüze çykardy we elektron kabul edijiniň ýerini III toplumyň ubihinol baglanyşýan böleginde kesgitledi. Üçünji barlag pes konsentrasiýalaryň dynçlyk ýagdaýyndaky kislorod sarp edilişini artdyrandygyny, emma ADP bilen güýçlendirilen dem alşy üýtgetmändigini ýüze çykardy. Bu pikiriň iň göni beýany şeýle: metilen gögüniň döredýän kislorod sarp edilişi oksidleýji fosforlanma asla bagly däl; ol dem alyş zynjyry petiklenende-de, şeýle zynjyry bolmadyk preparatlarda-da dowam edipdir.

Bu iki ululygyň arasyndaky tapawudyň göni ölçegleri hem bar. Alakanyň izolirlenen bagyr mitohondriýalarynda boýagyň konsentrasiýasynyň ýokarlanmagy dem alyş gözegçilik gatnaşygy görkezijilerini peseldip, çişmä sebäp bolupdyr. Awtorlar muny oksidleýji fosforlanmanyň birikmesiniň bozulmagy diýip häsiýetlendiripdirler. Perfuzirlenen alaka bagrynda metilen gögi kislorodyň sarp edilişini artdyrypdyr, şol bir wagtyň özünde ATP-niň ADP-ä gatnaşygy peselipdir.

Kliniki maglumatlar hem şol bir manyny berýär. Metgemoglobinemiýa NADPH-a bagly gaýtarylma ýoly arkaly beden agramynyň her kilogramyna takmynan bir-iki milligram metilen gögüni wena içine bermek bilen bejerilýär, has uly dozalar bolsa bejerilýän ýagdaýyň özüni döredýär. Şol syn makalasy antidot täsiriniň bitewi eritrositlerde iň güýçlüdigini we gemoliz bar mahaly gowşaýandygyny hem belleýär. Bu 1930-njy ýyldaky gemoliz baradaky netijäniň ýetmiş üç ýyl soň hassahana şertlerinde gaýtadan ýüze çykmagydyr. Peýdaly we zyýanly täsirleri doza çäginiň iki tarapynda ýerleşýän birleşmäniň dozasyny kislorod sarp edilişiniň ölçeginden çykarmak bolmaz.

Näme üçin önüm tapgyry hem ara alnyp maslahatlaşylmaly

Harrop bilen Barron gaýtadan üns berip okamaga mynasyp bir zady belläpdirler. Metilen gögüniň özi spektroskopda metgemoglobiniň iki häsiýetli zolagynyň arasynda bir zolak döredýär; bu bolsa «ýüzleý seredilende aňsatlyk bilen bulaşyklyga sebäp bolup biler». Boýag gözlenýän maddany öýkünip biler.

Şol meseläniň himiki görnüşi hem bar. Az mukdarly düzüm bölegi hökmünde bar bolan ýakyn fenotiazin birleşmesiniň öz oksidlenme-gaýtarylma häsiýetleri, öz geçirijiligi we öz zäherliligi bar. Resminamalaşdyrylan bir mysal munuň näme üçin möhümdigini anyk görkezýär: metilen gögüniň ýodlaşdyrylmagy baradaky barlagda takmynan 7–8 göterim Azure B saklaýan nusgalar esasan ýodlaşdyrylan Azure B öndüripdir. Şeýlelikde, reaksiýada metilen gögi däl-de, goşundy agdyklyk edipdir.

Metilen gögüni reagent hökmünde laboratoriýada, boýag stolunda ýa-da akwariumda ulanýan her bir adam, önüm tapgyry häsiýetlendirilmedik bolsa, anyk kesgitlenmedik düzüm bölegi bilen işleýär. Baglanyşykly maddalar, maddanyň hakykylygyny kesgitlemek, element goşundylary, galyndy eredijiler we ýakylandan soň galýan galyndy tejribäniň daşyndaky kagyz işleri däl-de, onuň bir bölegidir. Blupreme metilen gögüni derman öndürijisinden alýar we diňe agyr metallary däl, tutuş USP spesifikasiýasyny barlap, doly seljeriş şahadatnamasyny çap edýär. Seljeriş şahadatnamasyny okamak boýunça gollanma we USP derejesi diýen belligiň nämäni tassyklaýandygy we nämäni tassyklamaýandygy baradaky makala resminamany öňe sürülýän tassyklama bilen deňeşdirip barlamagyň ýoluny düşündirýär.

San dogrudy

1928-nji we 1930-njy ýyllaryň tejribeleri seresaply geçirilipdi we olaryň esasy syny häzire çenli güýjüni saklaýar: gaýtarylyp bilýän boýag örän az dem alýan öýjügi sianidiň petikleýän tapgyryndan geçmezden, dynçlyk ýagdaýyndaky tizliginden köp esse ýokary tizlikde kislorod sarp etmäge mejbur edip biler.

Ýalňyşlyk soň ýüze çykýar: «dem alyş» häzirki zaman manysynda okalanda. Gaz çalşygynyň ölçegi elektronlaryň kisloroda ýetendigini görkezýär. Ol şol elektronlaryň haýsydyr biriniň ATP öndürmek üçin ulanylandygyny görkezmeýär. Mitohondriýasy bolmadyk öýjükde bolsa bu iki pikiriň arasyndaky tapawut mümkin boldugyça uludyr. Metilen gögüniň öýjüklerde edýän işleriniň has giň kartasy şol bir tapawudy has giň çäkde görkezýär, birleşmäniň boýagdan dermana çenli taryhy bolsa dokma boýagynyň başda bu tejribelere nähili gelip ýetendigini düşündirýär.