การพิสูจน์เอกลักษณ์เมทิลีนบลูในห้องปฏิบัติการ: สเปกตรัมอินฟราเรดและวิธีเสริม

ลองนึกภาพว่าห้องปฏิบัติการสามแห่งได้รับผงสีน้ำเงินชนิดเดียวกัน แห่งแรกบันทึกสเปกตรัมอินฟราเรดและระบุว่าเป็นเมทิลีนบลู แห่งที่สองทำโครมาโทกราฟีและรายงานว่ามี Azure B 0.4% แห่งที่สามใช้รังสีเอกซ์ตรวจการเลี้ยวเบนจากผลึกและระบุรูปแบบไฮเดรต ทั้งสามแห่งให้คำตอบที่ถูกต้อง แต่ไม่มีแห่งใดตอบคำถามอีกสองข้อ ความสับสนเริ่มขึ้นเมื่อมีการตีความผลเพียงรายการเดียวว่าเป็นคำตอบของทั้งสามข้อ

บทความนี้แยกคำถามเหล่านั้นออกจากกัน การพิสูจน์เอกลักษณ์ด้วยอินฟราเรดยืนยันเอกลักษณ์ระดับโมเลกุลโดยเทียบกับสารมาตรฐานอ้างอิง โครมาโทกราฟียืนยันองค์ประกอบ การเลี้ยวเบนยืนยันรูปแบบในสถานะของแข็ง ผลการเทียบเอกลักษณ์ที่ผ่านเกณฑ์ไม่ใช่ใบรับรองความบริสุทธิ์

การพิสูจน์เอกลักษณ์ด้วยอินฟราเรดตอบคำถามหนึ่งข้อได้ดี

การทดสอบเอกลักษณ์เมทิลีนบลูตามตำรายาเป็นการเปรียบเทียบสเปกตรัมกับสารมาตรฐาน ไม่ใช่การตรวจตามรายการพีก ในตัวอย่างข้อกำหนดเมทิลีนบลูของ USP การพิสูจน์เอกลักษณ์ A ระบุให้ใช้อินฟราเรดสเปกโทรสโกปี โดยใช้ระบบเชิงแสงแบบ ATR หรือเม็ดอัดโพแทสเซียมโบรไมด์ สเปกตรัมของตัวอย่างต้องสอดคล้องกับสเปกตรัมของสารมาตรฐานอ้างอิง USP โดยเตรียมและบันทึกทั้งตัวอย่างและสารมาตรฐานภายใต้สภาวะที่เทียบเท่ากัน ไม่มีรายการเลขคลื่นบ่งชี้ที่ตายตัวเป็นตัวตัดสิน การซ้อนทับสเปกตรัมต่างหากที่ใช้ตัดสิน

แนวทางนี้สะท้อนลักษณะของสเปกตรัม FTIR ของเมทิลีนบลู ลักษณะเด่นที่เข้มที่สุดอยู่ในบริเวณลายนิ้วมือ งานตีความแถบสเปกตรัมในวรรณกรรมระบุตรงกันว่าแถบหลักของวงแหวนคอนจูเกตอยู่ใกล้ 1590 ถึง 1600 cm-1 ซึ่งโหมดการสั่นแบบยืดของพันธะคาร์บอน-คาร์บอนและคาร์บอน-ไนโตรเจนในวงแหวนอะโรมาติกเกิดการควบคู่กัน แถบเพิ่มเติมใกล้ 1490 และ 1390 cm-1 มีลักษณะของการสั่นของวงแหวน พันธะคาร์บอน-ไนโตรเจน และการสั่นแบบเปลี่ยนรูปของพันธะคาร์บอน-ไฮโดรเจน แถบใกล้ 1355 และ 1330 cm-1 เกี่ยวข้องกับพันธะคาร์บอน-ไนโตรเจนของหมู่ไดเมทิลอะมิโนและการสั่นแบบเปลี่ยนรูปของหมู่เมทิล ลักษณะเด่นใกล้ 1225 ถึง 1250 cm-1 เป็นของโครงร่างเฮเทอโรไซคลิก ส่วนแถบใกล้ 1170 ถึง 1130 และ 1066 cm-1 มีลักษณะของพันธะคาร์บอน-กำมะถัน โดยมีการสั่นแบบงอของ C-H ในวงแหวนอะโรมาติกใกล้ 880 cm-1 โหมดการสั่นแบบยืดปรากฏที่เลขคลื่นสูงกว่า ได้แก่ C-H ในวงแหวนอะโรมาติกใกล้ 3040 cm-1 และ C-H ของหมู่ N-เมทิลระหว่างประมาณ 2900 และ 3000 cm-1 การตีความแถบสเปกตรัมที่ตีพิมพ์มีรายละเอียดแตกต่างกัน เพราะโครงร่างฟีโนไทอะซิเนียมสั่นเป็นระบบที่มีการควบคู่กัน จึงควรมองตารางการตีความแต่ละตารางว่าเป็นผลที่มีผู้รายงาน ไม่ใช่คำอธิบายเดียวที่เป็นไปได้

ผลจากการเตรียมตัวอย่างสองประการควรได้รับความสนใจ เพราะทำให้สเปกตรัม IR ของเมทิลีนบลูเปลี่ยนไปโดยไม่ได้เปลี่ยนตัวสีย้อม ประการแรก วัสดุที่มีน้ำในรูปไฮเดรตแสดงแถบ O-H กว้างบริเวณ 3300 ถึง 3500 cm-1 รวมถึงการสั่นแบบงอของน้ำใกล้ 1630 ถึง 1640 cm-1 และรูปแบบไฮเดรตที่ต่างกันทำให้แถบในบริเวณลายนิ้วมือเลื่อนไปอย่างวัดได้ ประการที่สอง เมทริกซ์ของเม็ดอัด KBr ดูดความชื้นได้ ความชื้นที่ดูดซับไว้ทำให้เกิดแถบในบริเวณของน้ำเหล่านั้นพอดี และอาจดูเหมือนเป็นน้ำในไฮเดรตของตัวอย่าง การวัดแบบ ATR ไม่ใช้เมทริกซ์ KBr แต่ความเข้มของ ATR แปรตามความลึกของการแทรกผ่านซึ่งขึ้นกับเลขคลื่น ดังนั้นสเปกตรัม ATR และสเปกตรัมแบบส่งผ่านของผงชนิดเดียวกันจึงไม่สามารถนำมาซ้อนทับกันโดยตรงได้ หลักปฏิบัติจึงเป็นไปตามข้อกำหนดของตำรายา คือเปรียบเทียบตัวอย่างกับสารอ้างอิงที่บันทึกด้วยเทคนิคเดียวกัน และบันทึกว่าใช้เทคนิคใด สำหรับเคมีพื้นฐานของแคตไอออน เกลือ และไฮเดรตที่อยู่เบื้องหลังสเปกตรัมเหล่านี้ ดูข้อมูลอ้างอิงโครงสร้างและสมบัติของเมทิลีนบลู

ตารางเลือกวิธีวิเคราะห์

ตารางนี้เป็นเครื่องมือสำหรับเลือกวิธี อ่านแต่ละแถวจากซ้ายไปขวาเพื่อดูว่าวิธีนั้นตอบคำถามใด ผลที่ผ่านเกณฑ์ยืนยันอะไร และอะไรยังไม่ได้รับการพิสูจน์

เหตุใดผลอินฟราเรดที่ตรงกันจึงไม่ใช่ใบรับรองความบริสุทธิ์

ผลการเทียบเอกลักษณ์ที่ตรงกันช่วยตัดความเป็นไปได้ว่าเป็นสีย้อมผิดชนิด แต่ไม่ได้แจกแจงองค์ประกอบทั้งหมดของตัวอย่าง ข้อจำกัดที่สำคัญที่สุดมีสามประการ

ประการแรก สารที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกันให้สเปกตรัมอินฟราเรดคล้ายกัน Azure B ต่างจากเมทิลีนบลูเพียงหมู่เมทิลหนึ่งหมู่ สเปกตรัมจึงคล้ายกับเมทิลีนบลูมาก สารผสมที่มี Azure B อยู่ไม่กี่เปอร์เซ็นต์ยังคงซ้อนทับกับสเปกตรัมอ้างอิงของเมทิลีนบลูได้ดี การตรวจสิ่งเจือปนนี้เป็นหน้าที่ของโครมาโทกราฟี ซึ่งอธิบายไว้ในคู่มือสิ่งเจือปนและวิธีทดสอบเมทิลีนบลู

ประการที่สอง อินฟราเรดสเปกโทรสโกปีเป็นเทคนิคที่ตรวจตัวอย่างโดยรวมและมีความไวจำกัดต่อองค์ประกอบปริมาณน้อย สีย้อมที่มีโครงสร้างใกล้เคียง ตัวทำละลายตกค้าง หรือสารตกค้างอนินทรีย์ในปริมาณเล็กน้อยอาจซ่อนอยู่ใต้แถบหลัก การไม่พบพีกเพิ่มเติมจึงเป็นหลักฐานที่มีน้ำหนักน้อยในการบอกว่าไม่มีสิ่งเจือปน

ประการที่สาม สารมาตรฐานอ้างอิงเป็นตัวกำหนดการเปรียบเทียบทั้งหมด สารมาตรฐานที่เสื่อมสภาพ มีสเปกตรัมเลื่อนจากการเปลี่ยนแปลงของไฮเดรต หรือได้รับการจัดการอย่างไม่เหมาะสม ทำให้ฐานการตัดสินเปลี่ยนไป การจับคู่เทคนิคที่ไม่ตรงกันก็เช่นเดียวกัน เช่น การตัดสินสเปกตรัมตัวอย่างแบบ ATR เทียบกับสเปกตรัมอ้างอิงแบบ KBr ให้บันทึกรุ่นการผลิตของสารมาตรฐาน เทคนิค และการเตรียมไว้ควบคู่กับผลตัดสินทุกครั้ง

สารผสมยังมีข้อควรระวังอีกประการหนึ่ง สเปกตรัมที่ตรงกันเป็นส่วนใหญ่ แต่มีไหล่พีกหรือความเข้มผิดปกติ ไม่ใช่ผลผ่านที่เพียงเพิ่มหมายเหตุ แต่เป็นสัญญาณว่าควรแยกองค์ประกอบของตัวอย่างก่อนพิสูจน์เอกลักษณ์

วิธีเสริมในการใช้งานจริง

HPLC ของเมทิลีนบลูให้คำตอบเรื่ององค์ประกอบที่อินฟราเรดให้ไม่ได้ วิธีตามตำรายาในปัจจุบันใช้คอลัมน์ชนิดฟีนิลกับการไล่ระดับสัดส่วนน้ำ-อะซีโตไนไตรล์ที่มีกรดไตรฟลูออโรอะซิติก และตรวจวัดที่ 246 nm ไม่ใช่ในช่วงแสงที่มองเห็น การพิสูจน์เอกลักษณ์อาศัยเวลาคงอยู่ที่สอดคล้องกับสารมาตรฐานอ้างอิง การเปรียบเทียบเดียวกันนี้ใช้หาปริมาณสารด้วย การทดสอบสิ่งเจือปนอินทรีย์ระบุ Azure B โดยใช้วัสดุอ้างอิงของสารนั้นเอง ซึ่งมีเวลาคงอยู่สัมพัทธ์ใกล้ 0.8 เมื่อเทียบกับเมทิลีนบลูที่ 1.0 และกำหนดให้พีกทั้งสองแยกจากกันด้วยความละเอียดสูง ควรสังเกตการเลือกความยาวคลื่น: อนุกรมสารที่ถูกขจัดหมู่เมทิลดูดกลืนแสงเลื่อนไปทางสีแดงมากขึ้นตามลำดับ จากไทโอนีนใกล้ 600 nm ผ่าน Azure C, Azure A และ Azure B ไปจนถึงเมทิลีนบลูใกล้ 670 nm ดังนั้นเครื่องตรวจวัดที่ตั้งไว้ใกล้ 660 nm จึงตอบสนองต่อสารในอนุกรมนี้ไม่เท่ากัน และรายงานปริมาณสารร่วมอนุกรมบางชนิดต่ำกว่าความเป็นจริง หากต้องตรวจองค์ประกอบทั้งอนุกรมอย่างครบถ้วน ควรใช้วิธี C18 LC-MS/MS พร้อมสารมาตรฐานที่ผ่านการรับรองความเหมาะสมสำหรับสารวิเคราะห์แต่ละชนิด

การเลี้ยวเบนของผงตอบคำถามเรื่องสถานะของแข็ง ซึ่งสองวิธีข้างต้นทำลายข้อมูลหรือไม่ได้ตรวจสอบ กล่าวคือ การละลายผงเพื่อทำโครมาโทกราฟีทำให้ข้อมูลผลึกหายไป ส่วนการสั่นระดับโมเลกุลบอกข้อมูลพันธะ ไม่ใช่การจัดเรียงตัวระยะไกล รูปแบบการเลี้ยวเบนแยกแยะเฟสไฮเดรตและความเป็นผลึกได้ และเมทิลีนบลูจำเป็นต้องได้รับการตรวจสอบด้านนี้มากกว่าวัสดุส่วนใหญ่ งานวิจัยสถานะของแข็งโดย Rager และคณะระบุโครงสร้างไฮเดรตที่แตกต่างกันห้าชนิด ได้แก่ เพนตะไฮเดรต ไดไฮเดรตสองชนิด โมโนไฮเดรต และไฮเดรตตัวกลาง โดยไม่พบไตรไฮเดรตที่แท้จริงในบรรดารูปแบบที่ศึกษา การจัดการในห้องปฏิบัติการมีความสำคัญในเรื่องนี้ ความชื้นและอุณหภูมิทำให้เสถียรภาพของไฮเดรตเปลี่ยนไป และการบดอย่างรุนแรงอาจเปลี่ยนเฟสหรือลดความเป็นผลึก จึงควรควบคุมและบันทึกความชื้นสัมพัทธ์กับอุณหภูมิ และบดให้น้อยที่สุดเท่าที่จำเป็น การระบุไฮเดรตบนฉลากและผลต่อมวลที่ชั่งมีอธิบายเพิ่มเติมในรูปแบบไฮเดรตของเมทิลีนบลูและการระบุบนฉลาก

การดูดกลืน UV-Vis มีบทบาทสนับสนุน ตำแหน่งการดูดกลืนสูงสุดที่คุ้นเคยยืนยันพฤติกรรมของสารละลายตามที่คาดและช่วยให้หาความเข้มข้นได้ แต่สารละลายสีน้ำเงินที่ดูดกลืนแสง ณ ความยาวคลื่นที่คาดนั้นเพียงสอดคล้องกับการเป็นเมทิลีนบลู ไม่ได้พิสูจน์ว่าเป็นเมทิลีนบลู เพราะสีย้อมที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกันดูดกลืนแสงในบริเวณใกล้กัน

สิ่งที่ควรถามก่อนซื้อ

นำความแตกต่างเหล่านี้มาใช้ตั้งคำถามในการจัดซื้อ ถามว่าทดสอบรุ่นการผลิตใด ใช้เทคนิคใดพิสูจน์เอกลักษณ์ การทดสอบสิ่งเจือปนด้วย HPLC ใช้วัสดุอ้างอิง Azure B หรือไม่ และรูปแบบไฮเดรตได้รับการตรวจวิเคราะห์หรือเป็นเพียงการสันนิษฐาน สิ่งสำคัญที่สุดคือถามว่าใบรับรองครอบคลุมข้อกำหนดทั้งหมดหรือเฉพาะการทดสอบที่เลือกไว้ ผู้ขายจำนวนมากที่อ้างว่าเป็นไปตามตำรายาทดสอบเพียงโลหะหนัก จึงยังไม่ได้ตอบคำถามเรื่องเอกลักษณ์ ปริมาณสาร สิ่งเจือปนอินทรีย์ ตัวทำละลาย และจุลินทรีย์

Blupreme ทดสอบตามข้อกำหนด USP ครบถ้วน ครอบคลุมเอกลักษณ์ ความบริสุทธิ์ สิ่งเจือปนอินทรีย์ ตัวทำละลายตกค้าง สิ่งเจือปนธาตุ สารตกค้างหลังการเผา ขีดจำกัดจุลินทรีย์ และเอนโดทอกซินจากแบคทีเรีย โดยร่วมมือกับผู้ผลิตเมทิลีนบลูทางเภสัชกรรม ใบรับรองผลการวิเคราะห์ของแต่ละรุ่นการผลิตเผยแพร่ต่อสาธารณะบนหน้าการทดสอบคุณภาพของ Blupreme จึงอ่านฐานการหาปริมาณและผลสิ่งเจือปนได้โดยตรงแทนการอนุมาน ผลใกล้ 100% ยังต้องระบุฐานการคำนวณด้วย ดังที่คู่มือผลการหาปริมาณเกิน 100 เปอร์เซ็นต์ อธิบายไว้ การเทียบเอกลักษณ์ที่ตรงกันเป็นจุดเริ่มต้นของการตรวจสอบ ข้อมูลที่ครบถ้วนเป็นสิ่งที่ทำให้การตรวจสอบเสร็จสมบูรณ์