மெத்திலீன் நீலமும் மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களும்: எலக்ட்ரான் கடத்தலும் ஆதாரங்களும்

அடுத்தடுத்து வைக்கப்பட்டுள்ள இரண்டு சோதனைத் தயாரிப்புகளைக் கற்பனை செய்யுங்கள். இரண்டிலும், சுவாசச் சங்கிலியின் Complex I-ஐத் தடுக்கும் வேதிப்பொருளான ரோட்டினோனால் நச்சூட்டப்பட்ட மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் உள்ளன. அவற்றில் ஒன்றில், சோதனையாளர் பிப்பெட் மூலம் micromolar அளவிலான மெத்திலீன் நீலத்தைச் சேர்க்கிறார். ஆக்சிஜன் பயன்பாடு பகுதியளவு மீள்கிறது. சவ்வின் மின்னழுத்தம் பகுதியளவு திரும்புகிறது. சிறிதளவு ATP தொகுப்பு மீண்டும் தொடங்குகிறது. அருகிலுள்ள குவெட்டில், பெராக்சைடு உணரி கதையின் மறுபாதியைக் காட்டுகிறது: சோதிக்கப்பட்ட ஒவ்வொரு அளவிலும், பயன்படுத்தப்பட்ட ஒவ்வொரு மூலப்பொருளிலும், ஹைட்ரஜன் பெராக்சைடு உற்பத்தி பல மடங்கு அதிகரித்துள்ளது.

இரண்டு அளவீடுகளும் சரியானவை. மெத்திலீன் நீலம் ஓர் எலக்ட்ரான் கடத்தியாகச் செயல்பட்டு, சுவாசச் சங்கிலியின் சேதமடைந்த பகுதியைத் தவிர்த்து மின்னோட்டத்தைத் தொடரச் செய்ய முடியும்; அதே கடத்தல் நிகழும்போது பெராக்சைடு அதிகரிப்பு என்ற விலையும் உண்டு. இந்த இரண்டு உண்மைகளையும் ஒருசேர நினைவில் கொண்டால், மெத்திலீன் நீலத்தின் மைட்டோகாண்ட்ரியச் செயல்பாடு குறித்த ஆய்வு இலக்கியத்தைப் புரிந்துகொள்ள முடியும். ஒன்றை மட்டும் நினைவில் கொண்டால், முதலில் நீங்கள் படித்த ஆய்வுக் கட்டுரையைப் பொறுத்து அது அற்புதமாகவோ அச்சுறுத்தலாகவோ தோன்றும்.

கடத்தல் வழிமுறை, எளிய விளக்கம்

சுவாசச் சங்கிலி ஒரு தொடர் பரிமாற்றப் பாதை. எலக்ட்ரான்கள் Complex I-இல் (NADH-இலிருந்து) அல்லது Complex II மற்றும் தொடர்புடைய ஃபிளாவின் நொதிகளில் (சக்சினேட் மற்றும் ஒத்த கொடையாளிகளிடமிருந்து) நுழைகின்றன. அவை Complex III வழியாக நகரும் கடத்தியான சைட்டோகுரோம் c-ஐ அடைந்து, பின்னர் Complex IV வழியாக ஆக்சிஜனை அடைகின்றன. ஒவ்வொரு பரிமாற்றமும் உட்சவ்வின் குறுக்கே புரோட்டான்களை உந்துகிறது; இதனால் உருவாகும் சரிவு ATP தொகுப்பை இயக்குகிறது. எந்த நிலையையும் தடுத்தால், அதற்கு முந்தைய பாதையின் செயல்பாடு அடங்கிவிடுகிறது.

மெத்திலீன் நீலம் இணையான ஒரு கடத்தியாக இந்தப் பாதையில் நுழைகிறது. அதன் ஆக்சிஜனேற்றப்பட்ட வடிவம், பாதையின் முந்தைய கடத்திகளிடமிருந்து எலக்ட்ரான்களைப் பெற்று, நிறமற்ற ஒடுக்கப்பட்ட வடிவமான லியூகோமெத்திலீன் நீலமாக மாறுகிறது. பின்னர் அது அந்த எலக்ட்ரான்களைப் பாதையின் பிந்தைய பகுதிக்குக் கொடுத்துவிட்டு மீண்டும் நீல நிறத்திற்குத் திரும்புகிறது. இந்த இரண்டு வடிவங்களும் ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்க இணை குறித்த விளக்கத்தில் விவரிக்கப்பட்டுள்ளன; விரிவான தொடர் பரிமாற்றச் செயல்பாடு பொதுவான செயல்முறை விளக்கத்தில் இடம்பெறுகிறது. இந்தக் கடத்தி பாதையில் மீண்டும் எங்கே நுழைகிறது என்பதே இன்னும் தீராத கேள்வி: Qo தளம் எனப்படும் Complex III-இன் குவினால் பிணைப்பிடத்திலா, அல்லது நேரடியாகச் சைட்டோகுரோம் c-இலா? எந்த வெளியேற்றப் பாதை மேலோங்குகிறது என்பது சூழ்நிலைகளைப் பொறுத்தது; இதை Complex III-ஐத் தவிர்த்துச் செல்லும் பாதை குறித்த பகுப்பாய்வு விரிவாக விளக்குகிறது.

மூன்று கொறித்துண்ணி ஆய்வுகள் உண்மையில் அளந்தவை

மூன்று ஆய்வுகளிலும் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாக்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன. அதாவது, செல்லிலிருந்து அகற்றப்பட்ட நுண்ணுறுப்புகள், வரையறுக்கப்பட்ட தாங்கல் கரைசலில் மிதக்கவிடப்பட்டன. முழுமையான செல்களோ, மருந்தளிக்கப்பட்ட விலங்குகளோ, மனிதப் பங்கேற்பாளர்களோ இல்லை. செறிவுகள் என்பது நுண்ணுறுப்புகளைச் சுற்றியுள்ள கரைசலின் செறிவுகளைக் குறிக்கின்றன; மனிதருக்கான வாய்வழி அளவைக் குறிக்கவில்லை. இந்தச் சூழலை மனதில் வைத்தால், எண்கள் தெளிவாகப் பொருள்படும்.

முதல் ஆய்வு, தனிமைப்படுத்தப்பட்ட கினிப் பன்றியின் மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில் 100 nanomolar முதல் 2 micromolar வரை, ஒரே தயாரிப்பில் நன்மையையும் அதன் விலையையும் அளந்தது. ஆரோக்கியமான மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில் இந்தச் சாயம் ஓய்வுநிலை ஆக்சிஜன் பயன்பாட்டை அதிகரித்தது; ஆனால் ADP-ஆல் தூண்டப்பட்ட சுவாசத்தை மாற்றவில்லை. எனவே, இணைந்த ATP உற்பத்தி மேம்படவில்லை. Complex I தடுக்கப்பட்டபோது, 2 micromolar ATP தொகுப்பை 46-இலிருந்து 93 nanomoles per minute per milligram ஆக மீட்டது; இயல்பான வீதம் சுமார் 1109 ஆக இருந்தது. Complex III தடுக்கப்பட்டபோது, அதே அளவு ATP உற்பத்தியைச் சுமார் 46-இலிருந்து 63 ஆக மீட்டது; இயல்பான வீதம் சுமார் 910 ஆக இருந்தது. மின்னழுத்தமும் கால்சியம் உட்கொள்ளலும் பகுதியளவு மீண்டன. சயனைடால் ஏற்படுத்தப்பட்ட Complex IV தடையைத் தவிர்த்துச் செல்ல முடியவில்லை. இதனால், பயனுள்ள எலக்ட்ரான் வெளியேற்றப் புள்ளி, செயல்படும் Complex IV-க்கு முன்னதாக உள்ளது என்பது தெரிகிறது. ஒவ்வொரு மீட்பும் புள்ளியியல் அடிப்படையில் உண்மையானதாகவும் சிறியதாகவும் இருந்தது: இயல்பான ATP உற்பத்தியின் ஒற்றை இலக்க சதவீதங்களே.

இரண்டாவது ஆய்வு, எலியின் பெருமூளைப் புறணி மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில் சுமார் 1 micromolar அளவில், Complex I-ஐத் தவிர்த்துச் செல்லும் பாதையை உறுதிப்படுத்தியது; ஆனால் Complex III-இல் ஒரு வரம்பைக் கண்டது. ரோட்டினோன் சுவாசத்தைச் சுமார் 121-இலிருந்து 2 nanomoles of oxygen per minute per milligram-க்கும் கீழே குறைத்தது. சாயம் அதைச் சுமார் 21 ஆக உயர்த்தியது; இது இயல்பான அளவின் சுமார் ஆறில் ஒரு பங்கு. அதே நேரத்தில், சவ்வின் மின்னழுத்தம் கிட்டத்தட்ட முழுமையாக மீண்டது. ஆனால் Complex III தடுக்கப்பட்ட பிறகு, 1 முதல் 5 micromolar வரையிலான செறிவுகளில் சுவாசமோ மின்னழுத்தமோ மீளவில்லை; அந்தத் தடை, சாயத்தால் உருவான பெராக்சைடு சமிக்ஞையையும் ஒடுக்கியது. ஒடுக்கப்பட்ட சாயம் தனது எலக்ட்ரான்களை Complex III-இன் Qo தளத்தில் வழங்குவதாக ஆய்வாளர்கள் முன்மொழிந்தனர்: அந்தத் தளம் ஆக்கிரமிக்கப்பட்டிருந்தால், கடத்திக்கு எலக்ட்ரான்களை வழங்க இடமில்லை.

மூன்றாவது ஆய்வு, முக்கியமாக 2 micromolar அளவில் சுண்டெலி, பெருச்சாளி மற்றும் கினிப் பன்றியின் மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில், இந்த முரண்பாட்டை நேரடியாகச் சோதித்தது. Complex III தடையையும் கடந்து செல்ல முடியும் எனக் கண்டறிந்தது. Qo தளத் தடுப்பியான மைக்சோதையசோல் அடிப்படைச் சுவாசத்தை 88 percent குறைத்தபோது, சாயம் ஆக்சிஜன் பயன்பாட்டைத் தடுக்கப்படாத வீதத்தின் சுமார் 62 percent அளவிற்கு மீட்டது. ஒரு நேரடிச் சோதனையில், Complex III தடுக்கப்பட்டிருந்தபோதும் அரை micromolar அளவு வெளியிலிருந்து சேர்க்கப்பட்ட சைட்டோகுரோம் c-ஐ ஒடுக்கியது. இது NADH-இலிருந்து சாயம் வழியாகச் சைட்டோகுரோம் c-க்கும், அங்கிருந்து Complex IV-க்கும் செல்லும் பாதைக்கு ஆதரவளிக்கிறது. ஆனால் மீட்கப்பட்ட சுவாசம் இயல்புக்கு மாறாகச் செயல்பட்டது: சேர்க்கப்பட்ட ADP ஆக்சிஜன் பயன்பாட்டை உயர்த்துவதற்குப் பதிலாகக் குறைத்தது; ATP தொகுப்பைத் தடுப்பது சுவாசத்தைத் தூண்டியது. மின்னழுத்தம் பகுதியளவே மீண்டும் நிலைபெற்றது. தலைகீழான இணைப்புடன் கூடிய அதிக ஆக்சிஜன் பயன்பாடு, இயல்பான ஆற்றல் உற்பத்தி அல்ல.

ஆய்வகங்கள் ஏன் முரண்படுகின்றன, எது அதைத் தெளிவுபடுத்துகிறது

விலங்கின வேறுபாடு என்ற விளக்கம் முதலில் பொருந்தாமல் போகிறது. மூன்றாவது குழு மூன்று கொறித்துண்ணி இனங்களில் சோதனையை மீண்டும் நடத்தியது. இந்தத் தவிர்ப்புப் பாதை இல்லை என்று முன்னர் தெரிவிக்கப்பட்ட சுண்டெலி வகை உட்பட, அனைத்திலும் ஒரே வகையான தவிர்ப்புச் செயல்பாட்டைப் பெற்றது. மாறுபடுபவை செறிவு (1 மற்றும் 2 micromolar), தடுப்பிகளின் அளவுகள், தாங்கல் கரைசல்கள், தனிமைப்படுத்தும் முறைகள், எல்லாவற்றிற்கும் மேலாக ஒப்பிடப்படும் ஆற்றல் நிலை ஆகியவையே: ADP சேர்ப்பதற்கு முன்பே இந்தத் தவிர்ப்புப் பாதை மிகத் தெளிவாகத் தெரிகிறது; முரண்பாடான ADP எதிர்வினையும் அங்கேதான் தோன்றுகிறது. எனவே, உண்மையைப் பிரதிபலிக்கும் வரைபடம் சூழ்நிலைகளைச் சார்ந்த இரண்டு வெளியேற்றப் பாதைகளைக் காட்ட வேண்டும்: ஒன்று Qo தளத்தில், மற்றொன்று சைட்டோகுரோம் c-இல். உள்ளூர் வேதியியல் அனுமதிக்கும் இடத்தில் கடத்தி எலக்ட்ரான்களை வழங்குகிறது.

பெராக்சைடு என்ற விலை

மீட்பு குறித்த முடிவுகளைப் போலவே, அதன் விலை குறித்த முடிவுகளும் ஒரே மாதிரியாக உள்ளன. கினிப் பன்றி ஆய்வில், சோதிக்கப்பட்ட எல்லா நிலைகளிலும்—ஓய்வுநிலை, ATP தொகுப்பு நடைபெறும் நிலை, வேதிப்பொருட்களால் பாதிக்கப்பட்ட நிலை—மூன்று மூலப்பொருள்களிலும் சாயம் பெராக்சைடு வெளியீட்டை அதிகரித்தது. ATP தொகுப்பின்போது, 1 micromolar அளவில் உற்பத்தி சுமார் 148-இலிருந்து 1500 picomoles per minute per milligram-க்கும் மேலாக உயர்ந்தது. 100 nanomolar அளவுகூட சமிக்ஞையை நான்கு மடங்குக்கும் மேலாக அதிகரித்தது. சாயம் பெராக்சைடு அகற்றத்தையும் சுமார் 2.6 மடங்கு மெதுவாக்கியது. எனவே, இந்தச் சமிக்ஞை வேகமான உருவாக்கத்தையும் மெதுவான அகற்றத்தையும் பிரதிபலிக்கிறது. கண்டறியக்கூடிய சூப்பராக்சைடு உருவாகாமல், ஒடுக்கப்பட்ட சாயம் நேரடியாக ஆக்சிஜனை ஒடுக்குவதே முன்மொழியப்பட்ட வேதியியல் விளக்கம். இருப்பினும், இது நிரூபிக்கப்பட்ட படிநிலையாக அல்லாமல் ஒரு விளக்கமாகவே உள்ளது.

சுண்டெலி ஆய்வு இந்தச் சித்திரத்தைப் பயனுள்ள விதத்தில் சிக்கலாக்குகிறது. அளவு அதிகரிக்கும்போது பெராக்சைடு செங்குத்தாக உயர்ந்தது: அடிப்படை அளவான சுமார் 76-இலிருந்து, 2 micromolar அளவில் கிட்டத்தட்ட 2000 picomoles per minute per milligram வரை. ஆனாலும் Complex III தடை, சாயத்தால் ஏற்படும் கூறை ஒடுக்கியது. ஒடுக்கப்பட்ட சாயம் ஆக்சிஜனுடன் வினைபுரிவதிலிருந்து மட்டுமே பெராக்சைடு வந்திருந்தால், சங்கிலியைத் தடுப்பது இவ்வளவு தாக்கத்தை ஏற்படுத்தியிருக்கக் கூடாது. ஆனால் அது தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது; எனவே சங்கிலியும் இதில் பங்கேற்கிறது. ஆக்சிஜனேற்ற எதிர்ப்பு மற்றும் ஆக்சிஜனேற்ற ஊக்கச் செயல்பாடு குறித்த மதிப்பாய்வு இந்த இருமையை விரிவான சூழலில் விளக்குகிறது. ஆக்சிஜன் மற்றும் ATP குறித்த ஒப்பீட்டுப் பகுப்பாய்வு ஆக்சிஜன் அளவீடுகள் மட்டுமே ஏன் ஓர் ஆற்றல் கூற்றை உறுதிப்படுத்த முடியாது என்பதை விளக்குகிறது.

மீட்பு என்பது சீரமைப்பு அல்ல

இனி பயன்படுத்துவதை நிறுத்த வேண்டிய சொற்றொடர், "மெத்திலீன் நீலம் மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களைச் சீரமைக்குமா" என்பதே. சீரமைப்பு என்பது நீடித்த திருத்தத்தைக் குறிக்கும்: மீண்டும் கட்டமைக்கப்பட்ட கூட்டமைப்புகள், மருந்து நீங்கிய பிறகும் தொடரும் இணைப்பு, முழுமையான செல்களில் மீட்பு, பின்னர் உயிருள்ள ஓர் உயிரினத்தில் மேம்பட்ட செயல்பாடு. இந்த மூன்று ஆய்வுக் கட்டுரைகளில் எதுவும் அதை நிரூபிக்கவில்லை. அவை காட்டுவது, புதிதாகத் தனிமைப்படுத்தப்பட்ட நுண்ணுறுப்புகளில் செயற்கையான வேதித் தடையின்போது உடனடியாக ஏற்படும் பாதை மாற்றமே. அதில் ATP உற்பத்தி இயல்பான அளவின் சிறு பகுதிகளாகவே உள்ளது; சில சமயங்களில் இணைப்புச் செயல்பாடு வெளிப்படையாகவே விசித்திரமாக உள்ளது. ரோட்டினோனும் ஆன்டிமைசினும் ஆய்வகக் கருவிகள்; அவை முதுமையடைதல் அல்லது மனித மைட்டோகாண்ட்ரிய நோய்க்கான மாதிரிகள் அல்ல. இங்குள்ள எதுவும் ஆரோக்கியமான ஒருவருக்கு அதிக ஆற்றல் கிடைக்கும் என்று பொருள்படாது. அது தனக்கென மனித ஆய்வு இலக்கியத்தைக் கொண்ட தனியான ஆதாரக் கேள்வி.

எந்த உயிரியல் மேம்பாட்டுச் சோதனை முடிவையும் நேர்மையாக வைத்திருக்க மூன்று வரம்புகள் உதவுகின்றன. முதலாவது, சுற்றுக் கரைசலின் செறிவு என்பது மருந்தளவு அல்ல: தனிமைப்படுத்தப்பட்ட நுண்ணுறுப்புகளைச் சுற்றியுள்ள 0.1 முதல் 2 micromolar செறிவு, மனித மூளை மைட்டோகாண்ட்ரியத்தில் அதே கட்டற்ற செறிவை உருவாக்க எந்த வாய்வழி அளவு தேவை என்பதைச் சொல்லாது. குறிப்பாக, சவ்வின் மின்னழுத்தத்தைப் பொறுத்தே சாயம் குவிகிறது அல்லது வெளியேறுகிறது. இரண்டாவது, ஆக்சிஜன் என்பது ஆற்றல் அல்ல: பயனுள்ள பாஸ்போரிலேற்றத்தின் வழியாக மட்டுமல்லாமல், சுழற்சி மற்றும் கசிவின் வழியாகவும் சாயம் ஆக்சிஜன் பயன்பாட்டை உயர்த்த முடியும். எனவே ATP மற்றும் மின்னழுத்த அளவீடுகள் இல்லாத சுவாச அளவீடு, ஆற்றல் குறித்த கூற்றுக்கு ஆதாரமாகாது. மூன்றாவது, நன்மையும் சுமையும் ஒரே வாக்கியத்தில் இடம்பெற வேண்டும்: மீட்கப்பட்ட மின்னழுத்தம் அல்லது ATP குறித்த எந்தக் கூற்றும், அதனுடன் ஏற்பட்ட பெராக்சைடு உயர்வைத் தவிர்த்தால், அது சோதனையைத் தவறாக விவரிக்கிறது. தொடர்புடைய பிற வரையறைகள் NAD ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்க சமநிலை, அளவு–எதிர்வினை வளைவின் வடிவம் மற்றும் பரிசோதனை வழிகாட்டி ஆகியவற்றில் உள்ளன.

ஒரு நடைமுறைக் குறிப்பு: இந்தக் கடத்தல் செயல்பாடு குறிப்பிட்ட அந்த மூலக்கூறின் பண்பு. மெத்தில் குழுக்கள் நீக்கப்பட்ட Azure B போன்ற தொடர்புடைய சேர்மங்களும் ஆக்சிஜனேற்ற-ஒடுக்கச் செயல்பாடு கொண்டவை; ஆனால் அவற்றின் செயல்பாடு வேறுபடும். எனவே, பகுதியளவு சிதைந்த கரைசலைப் பயன்படுத்தும் சோதனை, சிதையாத சாயத்தைப் பயன்படுத்தும் சோதனையிலிருந்து வேறுபட்டது. உலோகங்களை மட்டும் பரிசோதிப்பதற்குப் பதிலாக, முழுமையான மருந்துத் தரநூல் விவரக்குறிப்பையும் வெளியிடப்பட்ட தொகுதி ஆவணத்தையும் வலியுறுத்துவதற்கான ஒரு காரணம் இதுவே. ஒளியூட்டப்பட்ட பயன்பாடுகளில், ஒளியால் இயக்கப்படும் வேதியியல் மற்றொரு எச்சரிக்கையையும் சேர்க்கிறது; இது சிவப்பு ஒளியுடன் இணைத்துப் பயன்படுத்துதல் என்பதன் கீழ் விளக்கப்பட்டுள்ளது.

இந்த அனைத்தையும் மீறியும் நிலைக்கும் குறுகிய கூற்று, தக்கவைத்துக்கொள்ளத் தகுந்தது: சேதமடைந்த தனிமைப்படுத்தப்பட்ட மைட்டோகாண்ட்ரியாக்களில் மெத்திலீன் நீலம், சூழ்நிலைகளைச் சார்ந்த எலக்ட்ரான் கடத்தியாகச் செயல்பட்டு, பெராக்சைடு அதிகரிப்பு என்ற விலையுடன் ஓட்டத்தைப் பகுதியளவு பாதுகாக்க முடியும். இதற்கு அப்பாற்பட்ட ஆற்றல், நீண்ட ஆயுள், சீரமைப்பு ஆகிய அனைத்துக்கும், இந்த ஆய்வுகள் வழங்குவதற்காகவே வடிவமைக்கப்படாத ஆதாரங்கள் இன்னும் தேவை.