Majaribio yaliyohusianisha bluu ya methilini na upumuaji wa seli

Damu ya binadamu iliyoondolewa fibrini, ikipashwa hadi 37 °C kwa saa tatu, hutumia karibu asilimia mbili ya oksijeni iliyomo ndani yake. Ongeza kiasi kidogo cha bluu ya methilini kabla ya kipindi hicho cha kuhifadhi katika halijoto hiyo, na damu hiyohiyo hutumia karibu asilimia sitini na tano. Hakuna kilichobadilika katika seli. Ni myeyusho tu uliobadilika.

Takwimu hiyo inatoka katika makala ya mwaka 1928 ya George Harrop na E. S. Guzman Barron wa Johns Hopkins, nayo ndiyo chimbuko la kauli inayorudiwa sana kwamba bluu ya methilini huboresha upumuaji wa seli. Kauli hiyo si ya uongo, lakini maana yake ni finyu zaidi kuliko inavyosikika.

Takwimu iliyo kwenye jedwali inapima nini hasa

Kipimo cha mwisho kilikuwa uchukuaji wa oksijeni, uliobainishwa kwa uchanganuzi wa gesi. Harrop na Barron walichuja damu iliyotolewa muda mfupi uliopita kupitia pamba katika 10 °C ili kuondoa seli nyeupe, wakaijaza sampuli oksijeni hadi kujaa, wakaigawanya, wakaongeza rangi katika sehemu moja, na wakachanganua sehemu zote mbili baada ya kipindi cha kuhifadhi katika halijoto iliyowekwa. Idadi ya seli nyeupe za damu haikuzidi mara nyingi takribani elfu moja kwa kila milimita ya ujazo. Matumizi ya oksijeni yaliripotiwa kama sehemu ya kiasi cha awali cha oksijeni katika sampuli iliyokuwa imetoweka.

Walipima pia dioksidi ya kaboni, lakini hapo mbinu ilileta matatizo. Damu iliyoondolewa fibrini ilitoa hadi milimoli mbili za dioksidi ya kaboni kwa kila 100 mL katika saa ya kwanza ya kuhifadhi katika halijoto iliyowekwa, kwa sababu zisizohusiana na mmenyuko uliokuwa ukichunguzwa. Kwa hiyo, uwiano wa dioksidi ya kaboni iliyotolewa kwa oksijeni iliyotumiwa katika damu nzima haukuweza kutumika. Ni seli zilizooshwa na kuwekwa katika myeyusho wa Locke pekee zilizotoa takwimu zilizoweza kufasiriwa, nazo zilijikita kati ya 0.73 na 0.80, iwe rangi ilikuwepo au haikuwepo.

Maelezo hayo si jambo dogo lisilo na umuhimu. “Upumuaji” katika makala hizi unamaanisha ubadilishanaji wa gesi ndani ya chombo kilichofungwa. Tofauti kati ya matumizi ya oksijeni na uzalishaji wa nishati inayoweza kutumika inachunguzwa kando katika kile ambacho matumizi ya oksijeni yanakuambia na yasichokuambia kuhusu ATP.

Rangi iliongeza zaidi pale seli zilipopumua kidogo zaidi

Erithrositi zilizokomaa za mamalia zina matumizi ya oksijeni ambayo karibu hayawezi kupimika. Erithrositi za ndege zenye kiini zina matumizi yanayopimika. Harrop na Barron walifanyia majaribio aina zote mbili, na tofauti hiyo ndiyo msingi wa hoja yao.

Katika sampuli za mamalia, rangi iliongeza matumizi kwa mara ishirini hadi hamsini. Katika damu ya bata bukini, ambayo seli zake tayari zilikuwa zinapumua, haikuwahi kuongeza kiwango zaidi ya mara mbili. Kadiri upumuaji wa awali ulivyokuwa mkubwa, ndivyo rangi ilivyoweza kuongeza kidogo zaidi.

Mwelekeo huohuo unaonekana ndani ya spishi moja. Sampuli ya binadamu kutoka kwa mgonjwa mwenye polycythemia vera, iliyokuwa na seli ambazo hazijakomaa, ilitumia asilimia 11.3 ya oksijeni yake bila rangi, ikilinganishwa na asilimia 2.8 kwa seli zilizooshwa kutoka kwa mtoaji mwenye afya. Rangi iliifikisha katika asilimia 63.4 tu, ongezeko la kasi la mara sita, ilhali seli za kawaida ziliongeza kasi karibu mara thelathini. Rangi ilizisukuma seli zilizokomaa kuelekea tabia ya zile ambazo hazijakomaa, jambo ambalo waandishi walisema ilikuwa ikifanya.

Sianidi ilipaswa kuizuia

Ilijulikana kwamba sianidi huzuia oksidesheni ya seli. Hata hivyo, Harrop na Barron waliiongeza pamoja na rangi.

Matokeo ya damu ya ng’ombe yanawakilisha matokeo hayo kwa ujumla. Kiasi cha oksijeni kilishuka kutoka 22.61 hadi 22.03 asilimia kwa ujazo katika saa tatu bila kuongeza chochote. Pamoja na bluu ya methilini, kilishuka hadi 12.84. Pamoja na bluu ya methilini na sianidi ya potasiamu ya sehemu moja ya elfu tano ya molari, kilishuka hadi 12.74. Kimsingi, athari ya rangi haikubadilika.

Kielelezo: rekodi endelevu ya upumuaji kwa kiwango kidogo wa erithrositi za binadamu. Mshale unaonyesha wakati bluu ya methilini ilipoongezwa. Kabla yake, mstari ni karibu tambarare; baada yake, hupanda kwa mwendo thabiti. Imenakiliwa kutoka kwa Harrop na Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Hitimisho lao lilikuwa kwamba rangi ilifanya kazi kama kibebaji cha oksijeni, “ikitoa dutu ambayo imetoweka katika erithrositi zisizo na kiini za mamalia waliokomaa.” Miaka miwili baadaye, Michaelis na Salomon katika Taasisi ya Rockefeller waliweka tofauti hiyo ya maoni katika namna ambayo imedumu. Ama athari ya rangi ilikuwa “sifa ya rangi iliyojitokeza kwa bahati,” au rangi ilikuwa “mfano wa dutu fulani isiyojulikana katika viumbe.” Swali hilo kati ya uwezekano huo miwili bado halijatatuliwa. Kilichobadilika ni kwamba sasa seli zinaweza kuelezwa kwa usahihi mkubwa zaidi.

Dondoo la ini lilifanya jambo lilelile

Michaelis na Salomon walionyesha kwamba dondoo za viungo zilizotolewa kwa maji baridi huchochea ongezeko lilelile. Ini la panya lilikuwa na athari kubwa zaidi, likifuatiwa na figo, wengu, na korodani. Ubongo, misuli, na seramu ya damu vilikuwa na athari ndogo au havikuwa nayo kabisa.

Kisha walijaribu dondoo hilo pamoja na monoksidi ya kaboni. Upumuaji uliochochewa na dondoo au rangi haukubadilika katika mchanganyiko wa asilimia 98 ya monoksidi ya kaboni na asilimia 2 ya oksijeni. Mchanganyiko huohuo wa gesi ulizuia upumuaji wa chachu na wa erithrositi za kuku zenye kiini kwa takribani asilimia 60 hadi 80, kulingana na maelezo ya Warburg kuhusu kimeng’enya cha upumuaji kinachoathiriwa na monoksidi ya kaboni. Kwa hiyo, dutu hiyo ya tishu ambayo haikuwa imetambuliwa haikuwa kimeng’enya cha Warburg.

Dutu kadhaa zilizodhaniwa kuwa ndizo ziliondolewa katika uchunguzi. Glutathioni iliyofanyiwa redaksheni na sisteini zilisababisha tu matumizi ya oksijeni yaliyohitajika kwa oksidesheni yao wenyewe. Koenzimu ya Harden na Young iliondolewa kwa sababu misuli ina kiasi chake kikubwa zaidi, lakini ilikuwa karibu na yenye athari ndogo zaidi. Saitokromu ya Keilin, iliyokuwa imepewa jina miaka michache mapema, ilikabiliwa na mkanganyiko huohuo. Pendekezo lao wenyewe, kwamba dutu inayofanya kazi ilitoka katika kiini cha seli, waliliita pendekezo tu.

Athari hiyo ilitegemea masharti fulani

Seli zilipaswa kubaki nzima. Hemolisisi iliyosababishwa na maji yaliyosafishwa kwa kunereka au kugandishwa mara kwa mara iliondoa mwitikio kwa rangi na dondoo, na hemolisisi ya sehemu ya seli iliupunguza mwitikio kwa uwiano unaolingana.

Sukari ilihitajika pia. Glukosi, fruktosi, na sukrosi ziliwezesha upumuaji uliochochewa na rangi; manitoli haikuufanya hivyo. Bila sukari, hakukuwa na upumuaji kabisa, na rangi ilionekana kuharibu seli wakati huo, hivyo glukosi iliyoongezwa saa moja au mbili baadaye haikurejesha upumuaji. Waandishi walipendekeza kwamba rangi ilikuwa ikifanya oksidesheni ya sehemu ya kimuundo ambayo seli ilihitaji.

Mwanga uliongeza athari ya rangi kwa kiasi kikubwa, ingawa athari hiyo ilionekana wazi hata gizani. Rangi nyingine zinazoweza kufanyiwa redaksheni zilifanya kazi kwa namna tofauti: bluu ya toluylene ililingana na bluu ya methilini au kuizidi, ilhali disulfonati ya indigo haikufanya karibu chochote. Hakukuwa na uhusiano wazi kati ya potenshali ya oksidesheni-redaksheni ya rangi na ukubwa wa athari yake, jambo ambalo waandishi walihusisha na uwezo wa kupenya utando na sumu.

Athari ilifuata uchachushaji, si upumuaji

Utafiti wa Barron wa 1930 ulihama kutoka mchanganyiko wenye seli zinazoelea hadi vipande vyembamba vya tishu za viungo vya kawaida vya panya na uvimbe uliopandikizwa.

Katika tishu zisizokuwa na glikolisi ya aerobiki, bluu ya methilini haikufanya chochote au ilipunguza kidogo matumizi ya oksijeni: figo kwa karibu asilimia 14, kongosho kwa karibu asilimia 14, na ini kwa karibu asilimia 5. Katika tishu zinazochachusha huku oksijeni ikiwa ipo, iliongeza matumizi: wengu kwa karibu asilimia 8, na ubongo kwa karibu asilimia 13. Ongezeko katika uvimbe lilianzia karibu asilimia 27 katika kansa ya matiti ya binadamu hadi zaidi ya asilimia 80 katika sarkoma ya Rous ya kuku, likiwa takribani sawia na glikolisi ya aerobiki ya kila tishu.

Kielelezo: kila nukta ni aina moja ya tishu. Mhimili mlalo ni glikolisi ya aerobiki; mhimili wima ni mabadiliko katika matumizi ya oksijeni baada ya bluu ya methilini. Data kutoka kwa Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Jedwali 6, PMID 19869777.

Kisha jaribio la sianidi lilitoa matokeo yaliyo kinyume. Upumuaji katika tishu hizo ambazo awali hazikuitikia ulipozuiwa kwa sianidi na uchachushaji ukajitokeza, rangi iliongeza tena matumizi ya oksijeni: figo kwa karibu asilimia 59, ini kwa karibu asilimia 19, wengu kwa karibu asilimia 286, na korodani kwa karibu asilimia 200.

Barron alipendekeza kwamba rangi ingeweza kutumika kama kipimo cha uwezo wa seli au tishu kufanya uchachushaji, na akamalizia kwa dhana: vizazi vya ukuzaji wa uvimbe katika mazingira yenye rangi huenda siku moja vingefanya metaboli ya uvimbe iwe kama ya tishu za kawaida kwa kudumu. Hilo lilikuwa swali la utafiti lililoandikwa mwaka 1930. Si dai la matibabu.

Kile ambacho majaribio hayangeweza kuwa yanapima

Katika 1928 na 1930, “upumuaji” ulimaanisha matumizi ya oksijeni. Adenosini trifosfati iliripotiwa kwa mara ya kwanza mwaka 1929, na uthibitisho kwamba mitokondria iliyotengwa huunganisha fosfati kwa vifungo vya esta huku ikihamisha elektroni ulitokea mwaka 1949. Hakuna makala yoyote ya awali kuhusu bluu ya methilini ambayo ingeweza kuwa imepima uzalishaji wa nishati, na hakuna iliyodai kufanya hivyo.

Seli ndizo tatizo la pili. Erithrositi zilizokomaa za mamalia hazina mitokondria. Katika hatua ya retikulositi, huondoa mitokondria na ribosomu kwa autofajia teule, ndiyo maana seli nyekundu iliyokomaa hutegemea glikolisi kwa nishati na hutegemea njia yake ya pentosi fosfati hasa kwa NADPH badala ya ATP. Katika majaribio ya 1928, hakukuwa na mnyororo wa usafirishaji wa elektroni wa kukarabatiwa. Chochote kilichokuwa kinatumia oksijeni kilikuwa kinafanya jambo jingine.

Sasa jambo hilo jingine limeelezwa kwa kiwango cha kuridhisha. Bluu ya methilini hupokea elektroni kutoka kwa vibebaji vya uwezo wa redaksheni ndani ya seli na kuwa leukobluu ya methilini, ambayo hufanyiwa oksidesheni tena na oksijeni ya molekuli, na hivyo kukamilisha mzunguko. Katika seli nyekundu za damu za binadamu, kimeng’enya cha flavini redaktasi kinachotegemea NADPH na vimeng’enya vinavyohusiana nacho vya disulfidi redaktasi hufanya hatua ya redaksheni. Utafiti wa 1976 uliotumia glukosi iliyowekewa alama uligundua kwamba rangi huchochea njia ya heksozi monofosfati, kwamba athari katika ukolezi mdogo ilitegemea oksihemoglobini, na kwamba ukolezi mkubwa zaidi, 0.1 mM, ulizalisha peroksidi ya hidrojeni. Rangi iliyofanyiwa redaksheni inapokutana na oksijeni huzalisha peroksidi, si vifungo vya fosfati.

Katika mitokondria, hali ina utata zaidi kuliko muhtasari maarufu unavyokubali. Mwelekeo mmoja wa utafiti unashikilia kwamba rangi huchukua elektroni kutoka eneo la kompleksi I na kuzikabidhi kwa saitokromu c. Mwingine uligundua kwamba katika mitokondria ya ubongo wa panya haiwezi kurejesha upumuaji baada ya kuzuiwa kwa antimaisini, na badala yake uliweka kipokezi cha elektroni kwenye eneo la kufungamana kwa ubikwinoli la kompleksi III. Wa tatu uligundua kwamba ukolezi mdogo uliongeza matumizi ya oksijeni katika hali ya msingi bila kubadilisha upumuaji uliochochewa na ADP. Kauli ya moja kwa moja zaidi kuhusu jambo hili ni kwamba matumizi ya oksijeni yanayochochewa na bluu ya methilini hayategemei kabisa fosforilesheni ya kioksidishaji: yaliendelea wakati mnyororo wa upumuaji ulipozuiwa, na katika maandalizi yasiyokuwa na mnyororo huo.

Vipimo vya moja kwa moja vya tofauti kati ya kiasi hicho viwili pia vipo. Katika mitokondria iliyotengwa kutoka ini la panya, kuongeza ukolezi wa rangi kulipunguza uwiano wa udhibiti wa upumuaji na kusababisha kuvimba, jambo ambalo waandishi walieleza kama kutenganishwa kwa fosforilesheni ya kioksidishaji. Katika ini la panya lililopitishiwa kiowevu, bluu ya methilini iliongeza matumizi ya oksijeni huku uwiano wa ATP kwa ADP ukishuka.

Rekodi za kitabibu zinatoa ujumbe huohuo. Methemoglobinemia hutibiwa kwa takribani miligramu moja hadi mbili za bluu ya methilini kwa kila kilogramu kupitia mshipa, kupitia njia ya redaksheni inayotegemea NADPH, na dozi kubwa zaidi husababisha hali inayotibiwa. Mapitio hayohayo yanaeleza kwamba athari ya kuondoa sumu ni kubwa zaidi katika erithrositi zilizo nzima na hupungua hemolisisi inapokuwepo. Huo ni ugunduzi wa hemolisisi wa 1930 unaojitokeza tena miaka sabini na mitatu baadaye katika mazingira ya hospitali. Kiambato ambacho athari zake zenye manufaa na zenye madhara ziko pande tofauti za kizingiti cha dozi si kiambato ambacho dozi yake inapaswa kukadiriwa kutokana na kipimo cha matumizi ya oksijeni.

Kwa nini bechi inahusika katika mjadala

Harrop na Barron waliona jambo linalostahili kusomwa tena. Bluu ya methilini yenyewe hutoa ukanda katika spektroskopu kati ya mikanda miwili bainifu ya methemoglobini, “jambo ambalo linaweza kusababisha mkanganyiko kwa urahisi katika uchunguzi wa haraka.” Rangi inaweza kuiga dutu inayotafutwa.

Tatizo hilohilo lina namna ya kikemia. Fenothiazini inayohusiana nayo na iliyopo kama sehemu ndogo ya mchanganyiko ina tabia yake yenyewe ya redoksi, uwezo wake wa kupenya utando, na sumu yake. Kisa kimoja kilichoandikwa kinaonyesha wazi umuhimu wa hili: katika utafiti wa kuunganisha iodini na bluu ya methilini, sampuli zilizokuwa na takribani asilimia 7 hadi 8 ya Azure B zilizalisha hasa Azure B iliyounganishwa na iodini. Kwa hiyo, uchafu huo, badala ya bluu ya methilini, ndio uliotawala mmenyuko.

Mtu yeyote anayetumia bluu ya methilini kama kitendanishi, katika maabara, kwenye meza ya kutia rangi sampuli, au katika tangi la samaki, anafanya kazi na kiambato ambacho hakijabainishwa isipokuwa bechi iwe imechunguzwa na sifa zake kubainishwa. Dutu zinazohusiana nayo, utambulisho, uchafu wa elementi, mabaki ya viyeyusho, na mabaki baada ya kuchomwa ni sehemu ya jaribio, si nyaraka tu zinazolizunguka. Blupreme hupata bluu yake ya methilini kutoka kwa mtengenezaji wa dawa na huchapisha cheti kamili cha uchanganuzi, ikipima vigezo vyote vya USP badala ya metali nzito pekee; mwongozo wa kusoma cheti cha uchanganuzi na kile ambacho jina la daraja la USP linathibitisha na lisichothibitisha vinaeleza jinsi ya kulinganisha hati na dai.

Takwimu ilikuwa sahihi

Majaribio ya 1928 na 1930 yalifanywa kwa uangalifu, na jambo kuu lililoonekana humo bado linathibitika: rangi inayoweza kufanyiwa redaksheni inaweza kufanya seli yenye upumuaji mdogo mno itumie oksijeni kwa kiwango cha mara nyingi zaidi ya kiwango chake cha msingi, bila kupitia hatua ambayo sianidi huzuia.

Kosa hujitokeza baadaye, wakati “upumuaji” unaposomwa kwa maana yake ya kisasa. Kipimo cha ubadilishanaji wa gesi kinakuambia kwamba elektroni zilifika kwenye oksijeni. Hakikuambii kwamba zozote kati yake zilitumika kutengeneza ATP, na katika seli isiyo na mitokondria, tofauti kati ya kauli hizo mbili ni kubwa kadiri inavyowezekana. Ramani pana ya kile bluu ya methilini hufanya katika seli inaweka tofauti hiyohiyo katika muktadha mpana zaidi, na historia ya kiambato hiki kutoka rangi hadi dawa inaeleza jinsi rangi ya nguo ilivyofikia majaribio haya hapo mwanzo.