Percobaan anu ngahubungkeun métilén bulao jeung réspirasi sélulér

Getih manusa anu fibrinna geus dipiceun, dipanaskeun nepi ka 37 °C salila tilu jam, ngonsumsi kira-kira dua persén oksigén anu dikandungna. Tambahkeun saeutik métilén bulao saméméh inkubasi, sarta getih anu sarua ngonsumsi kira-kira genep puluh lima persén. Teu aya anu robah dina sélna. Anu robah ngan ukur larutanana.

Angka éta asalna tina makalah taun 1928 ku George Harrop jeung E. S. Guzman Barron di Johns Hopkins, sarta jadi asal-usul pernyataan anu mindeng diulang yén métilén bulao ngaronjatkeun réspirasi sélulér. Éta pernyataan henteu salah, tapi hartina leuwih heureut tibatan anu kadéngé.

Naon anu sabenerna diukur ku angka dina tabél

Parameter ahirna nyaéta nyerepna oksigén, anu ditangtukeun ku analisis gas. Harrop jeung Barron nyaring getih anu kakara dicokot ngaliwatan kapas dina 10 °C pikeun miceun sél getih bodas, ngajenuhkeun sampel ku oksigén, ngabagi éta sampel, nambahkeun zat warna kana salah sahiji bagianna, sarta nganalisis duanana sanggeus inkubasi. Jumlah leukosit jarang ngaleuwihan kira-kira sarébu per miliméter kubik. Konsumsi oksigén dilaporkeun minangka bagian tina kandungan oksigén awal sampel anu geus leungit.

Maranéhna ogé ngukur karbon dioksida, tapi dina hal éta métodena nimbulkeun kasulitan. Getih anu fibrinna geus dipiceun ngaleupaskeun nepi ka dua milimol karbon dioksida per 100 mL dina jam kahiji inkubasi ku sabab anu henteu patali jeung réaksi anu keur ditalungtik, jadi hasil bagi réspirasi tina getih gembleng henteu bisa dipaké. Ngan sél anu geus dikumbah dina larutan Locke anu ngahasilkeun angka anu bisa diinterpretasi, sarta angka-angka éta ngumpul antara 0.73 jeung 0.80, boh maké zat warna boh henteu.

Éta rinci téh lain hal leutik anu teu penting. “Réspirasi” dina makalah-makalah ieu hartina patukeuran gas dina wadah katutup. Bédana antara konsumsi oksigén jeung énérgi mangpaat anu dihasilkeun dibahas misah dina naon anu bisa jeung henteu bisa dicaritakeun ku konsumsi oksigén ngeunaan ATP.

Zat warna panglobana nambahan réspirasi dina sél anu réspirasina panghandapna

Éritrosit mamalia anu geus dewasa ampir teu boga konsumsi oksigén anu bisa diukur. Éritrosit manuk anu boga inti mah boga. Harrop jeung Barron nguji duanana, sarta bédana jadi dasar utama argumén maranéhna.

Dina sampel mamalia, zat warna ngahasilkeun paningkatan dua puluh nepi ka lima puluh kali lipet. Dina getih soang, anu sélna geus ngalakukeun réspirasi, laju éta henteu kungsi ngaleuwihan dua kali lipet. Beuki luhur réspirasi awalna, beuki saeutik anu bisa ditambahkeun ku zat warna.

Pola anu sarua muncul dina hiji spésiés. Hiji sampel manusa ti pasién polisitémia véra, anu ngandung sél can dewasa, ngonsumsi 11.3 persén oksigénna tanpa zat warna, dibandingkeun jeung 2.8 persén pikeun sél anu geus dikumbah ti donor séhat. Zat warna ngan ningkatkeunana nepi ka 63.4 persén, nyaéta genep kali leuwih gancang, sedengkeun sél normal ngagancangkeun ampir tilu puluh kali lipet. Zat warna ngadorong sél dewasa sangkan kalakuanana leuwih siga sél can dewasa, sakumaha anu dijelaskeun ku panulis.

Sianida sakuduna ngeureunkeunana

Sianida dipikawanoh bisa ngeureunkeun oksidasi sélulér. Harrop jeung Barron tetep nambahkeunana, babarengan jeung zat warna.

Hasil tina getih sapi ngawakilan pola éta. Kandungan oksigén turun tina 22.61 jadi 22.03 persén volume salila tilu jam tanpa tambahan nanaon. Kalayan métilén bulao, éta turun jadi 12.84. Kalayan métilén bulao jeung kalium sianida dina konséntrasi hiji perlima rébu molar, éta turun jadi 12.74. Pangaruh zat warna dina dasarna henteu robah.

Gambar: rékaman mikroréspirasi éritrosit manusa anu terus-terusan. Panah nandaan waktu nambahkeun métilén bulao. Saméméhna, garis rékaman ampir datar; sanggeusna, garisna naék ajeg. Dihasilkeun deui tina Harrop jeung Barron, Journal of Experimental Medicine 48:207–223 (1928), PMID 19869478.

Kacindekan maranéhna nyaéta yén zat warna bertindak minangka pamawa oksigén, “nyadiakeun zat anu geus leungit tina éritrosit mamalia dewasa anu henteu boga inti.” Dua taun ti harita, Michaelis jeung Salomon di Rockefeller Institute ngarumuskeun éta béda pamadegan dina wangun anu terus dipaké. Bisa jadi pangaruh zat warna téh “sipat zat warna anu ngan kabeneran,” atawa zat warna téh “modél pikeun hiji zat anu can dipikawanoh dina organisme.” Dua kamungkinan éta can diputuskeun. Anu geus robah nyaéta yén ayeuna sél bisa dijelaskeun jauh leuwih taliti.

Ékstrak ati ngalakukeun hal anu sarua

Michaelis jeung Salomon némbongkeun yén ékstrak organ anu dijieun ku cai tiis ngahasilkeun stimulasi anu sarua. Ati beurit pangkuatna, dituturkeun ku ginjal, limpa, jeung téstis. Otak, otot, jeung sérum getih ngan boga pangaruh saeutik atawa euweuh pisan.

Maranéhna tuluy nguji ékstrak éta ngalawan karbon monoksida. Réspirasi anu dipicu ku ékstrak atawa zat warna henteu robah dina campuran 98 persén karbon monoksida jeung 2 persén oksigén. Campuran gas anu sarua ngahambat réspirasi ragi jeung éritrosit hayam anu boga inti ku kira-kira 60 nepi ka 80 persén, saluyu jeung pedaran Warburg ngeunaan férmén réspirasi anu sénsitip kana karbon monoksida. Ku kituna, zat jaringan anu can dipikawanoh éta lain énzim Warburg.

Sababaraha calon idéntitas gugur dina prosésna. Glutation teréduksi jeung sistéin ngan ngahasilkeun konsumsi oksigén anu diperlukeun pikeun oksidasi sorangan. Koénzim Harden jeung Young disingkirkeun sabab otot ngandung éta zat panglobana tapi némbongkeun pangaruh anu ampir panghandapna. Sitokrom Keilin, anu dingaranan sababaraha taun saméméhna, nyanghareupan patukang tonggong anu sarua. Pamadegan maranéhna sorangan, yén zat aktif éta asalna tina inti sél, disebut ku maranéhna ngan ukur hiji usulan.

Pangaruhna merlukeun kaayaan nu tangtu

Sélna kudu tetep gembleng. Hémolisis ku cai suling atawa katirisan anu diulang-ulang ngaleungitkeun réspon kana zat warna boh ékstrak, sarta hémolisis parsial ngurangan réspon sacara sabanding.

Gula ogé diperlukeun. Glukosa, fruktosa, jeung sukrosa ngarojong réspirasi anu dipicu ku zat warna; manitol henteu. Tanpa gula, euweuh réspirasi pisan, sarta zat warna katingalina ngaruksak sél dina prosésna, ku kituna glukosa anu ditambahkeun hiji atawa dua jam ti harita henteu mulangkeun réspirasi. Panulis ngusulkeun yén zat warna ngaoksidasi komponén struktural anu diperlukeun ku sél.

Cahaya ningkatkeun pangaruh zat warna sacara gedé, sanajan pangaruhna tetep écés dina poék. Zat warna séjén anu bisa diréduksi némbongkeun kalakuan anu béda: toluilén bulao sarua atawa ngaleuwihan métilén bulao, sedengkeun indigo disulfonat ampir henteu boga pangaruh. Teu katempo hubungan anu écés antara poténsial oksidasi-réduksi hiji zat warna jeung gedéna pangaruhna, anu ku panulis dipatalikeun jeung perméabilitas mémbran sarta toksisitas.

Pangaruhna nuturkeun férméntasi, lain réspirasi

Ulikan Barron taun 1930 pindah tina suspénsi sél kana irisan jaringan organ beurit normal jeung tumor anu dicangkokkeun.

Dina jaringan anu henteu boga glikolisis aérobik, métilén bulao henteu ngalakukeun nanaon atawa rada ngahambat konsumsi oksigén: dina ginjal ku kira-kira 14 persén, pankréas ku kira-kira 14 persén, ati ku kira-kira 5 persén. Dina jaringan anu ngalakukeun férméntasi dina ayana oksigén, zat éta ningkatkeun konsumsi: dina limpa ku kira-kira 8 persén, otak ku kira-kira 13 persén. Paningkatan dina tumor antara kira-kira 27 persén dina karsinoma payudara manusa nepi ka leuwih ti 80 persén dina sarkoma Rous dina hayam, kurang leuwih sabanding jeung glikolisis aérobik unggal jaringan.

Gambar: unggal titik ngawakilan hiji jinis jaringan. Sumbu horizontal nyaéta glikolisis aérobik; sumbu vértikal nyaéta parobahan konsumsi oksigén sanggeus métilén bulao ditambahkeun. Data ti Barron, Journal of Experimental Medicine 52:447–456 (1930), Tabél 6, PMID 19869777.

Percobaan sianida tuluy ngahasilkeun pola anu tibalik. Nalika réspirasi dina jaringan anu tadina henteu ngaréspon éta dipeungpeuk ku sianida sarta férméntasi jadi katempo, zat warna ningkatkeun deui konsumsi oksigén: dina ginjal ku kira-kira 59 persén, ati ku kira-kira 19 persén, limpa ku kira-kira 286 persén, téstis ku kira-kira 200 persén.

Barron ngusulkeun yén zat warna bisa dipaké minangka uji kamampuh férméntatif hiji sél atawa jaringan, sarta nutup ku hiji spekulasi: sababaraha generasi kultur tumor dina médium anu ngandung zat warna bisa waé hiji poé ngajadikeun métabolisme tumor sacara permanén siga métabolisme jaringan normal. Éta téh patalékan panalungtikan anu ditulis dina 1930. Éta lain klaim pangobatan.

Naon anu mustahil diukur ku percobaan éta

Dina 1928 jeung 1930, “réspirasi” hartina konsumsi oksigén. Adénosin trifosfat munggaran dilaporkeun dina 1929, sarta bukti yén mitokondria anu diisolasi ngaésterifikasi fosfat bari mindahkeun éléktron kakara muncul dina 1949. Euweuh makalah awal ngeunaan métilén bulao anu bisa ngukur produksi énérgi, sarta euweuh anu ngaku ngalakukeun éta.

Sélna jadi masalah kadua. Éritrosit mamalia dewasa henteu ngandung mitokondria. Dina tahap rétikulosit, sél miceun mitokondria jeung ribosom ngaliwatan autofagi séléktif, ku sabab éta sél getih beureum dewasa ngandelkeun glikolisis sarta gumantung kana jalur pentosa fosfatna utamana pikeun NADPH, lain pikeun ATP. Dina percobaan 1928, euweuh ranté transpor éléktron anu bisa dibebenah. Naon waé anu ngonsumsi oksigén téh ngalakukeun hal séjén.

Naon éta hal séjén téh ayeuna geus cukup écés dijelaskeun. Métilén bulao narima éléktron tina ékuivalén pangréduksi sélulér sarta jadi léukométilén bulao, anu dioksidasi deui ku oksigén molékulér, sahingga siklusna lengkep. Dina sél getih beureum manusa, flavin réduktase anu gumantung kana NADPH jeung disulfida réduktase anu patali ngalakukeun léngkah réduksi. Hiji ulikan taun 1976 anu maké glukosa berlabel manggihan yén zat warna ngarangsang jalur pintas héksosa monofosfat, yén pangaruh dina konséntrasi handap gumantung kana oksihémoglobin, sarta yén konséntrasi anu leuwih luhur, 0.1 mM, ngahasilkeun hidrogén péroksida. Zat warna anu geus diréduksi lamun papanggih jeung oksigén ngahasilkeun péroksida, lain beungkeut fosfat.

Dina mitokondria, gambaranana leuwih loba diperdebatkeun tibatan anu diaku ku ringkesan populér. Hiji arah panalungtikan nyebutkeun yén zat warna nyokot éléktron ti wewengkon kompléks I sarta masrahkeunana ka sitokrom c. Panalungtikan séjén manggihan yén dina mitokondria otak mencit, zat éta henteu bisa mulangkeun réspirasi sanggeus dipeungpeuk ku antimisin, sarta nempatkeun panarima éléktron di situs pangiket ubikuinol dina kompléks III. Panalungtikan katilu manggihan yén konséntrasi handap ningkatkeun konsumsi oksigén dina kaayaan istirahat bari henteu ngarobah réspirasi anu dirangsang ku ADP. Pernyataan anu panglangsungna ngeunaan hal ieu nyaéta yén konsumsi oksigén anu dipicu ku métilén bulao henteu gumantung pisan kana fosforilasi oksidatif: konsumsi éta tetep lumangsung nalika ranté réspirasi dihambat, sarta dina préparat anu henteu boga ranté éta.

Pangukuran langsung ngeunaan bédana antara dua kuantitas éta ogé aya. Dina mitokondria ati beurit anu diisolasi, paningkatan konséntrasi zat warna nurunkeun rasio kontrol réspirasi sarta nyababkeun ngabareuhan, anu ku panulis dijelaskeun minangka pegatna gandéngan fosforilasi oksidatif. Dina ati beurit anu dipérfusi, métilén bulao ningkatkeun konsumsi oksigén bari rasio ATP kana ADP turun.

Catetan klinis nepikeun pesen anu sarua. Méthémoglobinémia diubaran ku kira-kira hiji nepi ka dua miligram métilén bulao per kilogram sacara intravéna, ngaliwatan jalur réduksi anu gumantung kana NADPH, sarta dosis anu leuwih gedé nyababkeun kaayaan anu keur diubaran éta. Tinjauan anu sarua nyatet yén pangaruh antidotna panggedéna dina éritrosit anu gembleng sarta ngurangan lamun aya hémolisis, nyaéta timuan hémolisis taun 1930 anu muncul deui tujuh puluh tilu taun ti harita dina kontéks rumah sakit. Sanyawa anu pangaruh mangpaat jeung ngabahayakeunana aya di dua sisi ambang dosis lain sanyawa anu dosisna pantes disimpulkeun tina pangukuran konsumsi oksigén.

Naha bets kudu kaasup kana sawala

Harrop jeung Barron niténan hiji hal anu pantes dibaca deui. Métilén bulao sorangan ngahasilkeun pita dina spéktroskop di antara dua pita has méthémoglobin, “anu bisa gampang nimbulkeun kabingungan lamun ditilik sakolébat.” Zat warna bisa nyarupaan zat anu keur dipaluruh.

Masalah anu sarua boga wangun kimiawi. Fénotiazin anu patali, anu aya minangka komponén minor, boga kalakuan rédoks, perméabilitas, jeung toksisitas sorangan. Hiji kasus anu didokuméntasikeun ngajadikeun risikona nyata: dina ulikan iodinasi métilén bulao, sampel anu ngandung kira-kira 7 nepi ka 8 persén Azure B utamana ngahasilkeun Azure B anu diiodinasi, jadi pangotorna, lain métilén bulaona, anu ngadominasi réaksi.

Saha waé anu maké métilén bulao minangka réagén, di laboratorium, di méja ngawarnaan sampel, atawa dina akuarium, sabenerna keur gawé jeung bahan anu spésifikasina can écés lamun betsna can dikarakterisasi. Zat anu patali, idéntitas, pangotor unsur, sésa pangleyur, jeung résidu sanggeus dipijarkeun mangrupa bagian tina percobaan, lain saukur dokumén pangiringna. Blupreme meunang métilén bulaona ti produsén farmasi sarta medalkeun sertipikat analisis lengkep, kalayan nguji sakabéh spésifikasi USP, lain ngan logam beurat; pituduh maca sertipikat analisis jeung naon anu ditetepkeun jeung henteu ditetepkeun ku sebutan kelas USP ngajelaskeun cara mariksa dokumén jeung ngabandingkeunana kana klaim.

Angkana bener

Percobaan 1928 jeung 1930 dilakukeun kalawan taliti, sarta paniténan utamana tetep valid: zat warna anu bisa diréduksi bisa ngajadikeun sél anu ampir henteu ngalakukeun réspirasi ngonsumsi oksigén sababaraha kali laju istirahatna, tanpa ngaliwatan léngkah anu dipeungpeuk ku sianida.

Kasalahan muncul engké, nalika “réspirasi” dibaca maké harti modérnna. Pangukuran patukeuran gas nétélakeun yén éléktron geus nepi ka oksigén. Éta henteu nétélakeun yén aya éléktron anu dipaké pikeun nyieun ATP, sarta dina sél anu henteu boga mitokondria, jarak antara dua pernyataan éta lega pisan. Peta anu leuwih lega ngeunaan naon anu dilakukeun ku métilén bulao dina sél nempatkeun bédana anu sarua dina kerangka anu leuwih lega, sarta sajarah sanyawa ieu ti zat warna nepi ka ubar ngajelaskeun kumaha zat pewarna tékstil bisa asup kana percobaan-percobaan ieu ti mimiti.