Pol Erlih i metilensko plavo: kako je jedna boja pomogla da se oblikuje otkrivanje lekova

Doprinos Pola Erliha medicini nije bio lek. Bio je to stav o tome kako treba posmatrati lek.

Godine 1878. predao je doktorsku disertaciju čiji je uvodni deo nosio naslov „Hemijsko shvatanje bojenja“. U njoj je tvrdio da bojenje preseka tkiva i bojenje komada tkanine slede istu logiku. U oba slučaja boja se vezuje zbog hemijskog afiniteta između boje i materijala, a ne zato što je tkivo upijajuće, masno ili oblikovano tako da zarobi pigment. Erlih je odrastao gledajući svog rođaka, patologa Karla Vajgerta, kako priprema obojene preseke, a pažnju mu nisu zadržavale slike, već činjenica da boja bira gde će otići.

Tvrdnja zvuči skromno. Nije. Ako se boja vezuje za tkivo iz hemijskih razloga, onda obrazac bojenja govori o hemiji tog tkiva. Obojeni mikroskopski preparat prestaje da bude ilustracija i postaje merenje.

Odmah je nastavio da razvija tu ideju. Godine 1880. kombinovao je metilensko plavo sa kiselim fuksinom i nazvao tu mešavinu neutralnom bojom, neutralen Farbkörper, koja je razdvajala različite vrste belih krvnih zrnaca tamo gde pojedinačne boje koje su tada bile u upotrebi to nisu mogle. Dve godine kasnije predstavio je metodu bojenja bacila tuberkuloze metil-ljubičastim, a Koh je taj postupak usvojio u svom radu.

Teorija koja je kasnije ovim postupcima dala zajedničku osnovu zasebna je tema, a vreme njenog nastanka često se pojednostavljuje. Erlihova teorija bočnih lanaca, ideja da supstanca deluje na ćeliju zato što su hemijski kompatibilne, pripada 1890-im, a ne godinama eksperimenata sa bojama. Raniji rad doneo je uverenje koje joj je prethodilo: selektivnost je hemijska, pa se zato za njom može tragati umesto da se na nju slučajno naiđe.

Eksperiment koji je boju pretvorio u mapu

Godine 1885. Erlih je objavio monografiju o potrebama organizma za kiseonikom, sa podnaslovom koji ju je opisivao kao kolorimetrijsko-analitičku studiju. Metoda se sastojala u ubrizgavanju boja čija boja zavisi od oksidacionog stanja, a zatim u poređenju načina na koji ih različiti organi redukuju ili čuvaju. Boja je služila kao instrument, onako kako se koristi termometar: pokazivala je uslove unutar tkiva koji se nisu mogli neposredno ispitati. Sam Erlih je cilj opisao kao utvrđivanje redukcione moći živih organa uz pomoć određenih boja.

Rezultat sa metilenskim plavim pojavio se 1886. u radu o reakciji boje sa živom nervnom supstancom, predstavljenom medicinskom društvu prethodnog decembra. Metilensko plavo unošeno je u krvotok žive životinje, a zatim su uzimani tanki preseci tkiva i izlagani vazduhu kako bi se nakupljena bezbojna boja oksidovala ponovo u plavu i pokazala gde se sakupila. Nervne ćelije i nervna vlakna primali su boju, i to dovoljno selektivno da je tehnika postala standardna metoda za prikazivanje nervnog tkiva. Jedinjenje više nije bilo samo sredstvo za bojenje naneto na mrtav presek na laboratorijskom stolu. Bilo je marker koji se raspoređivao unutar živog tela, a taj raspored mogao se očitati.

Svojstvo koje leži u osnovi oba eksperimenta treba jasno navesti, jer sve ostalo u ovoj priči zavisi od njega. Promena metilenskog plavog je reverzibilna. Njegov redukovani oblik, leukometilensko plavo, bezbojan je, a u dodiru sa kiseonikom ponovo prelazi u plavi katjon. Rastvor boje sa glukozom u zatvorenoj tegli je bezbojan; kada se tegla otvori, postaje plav. Prema navodima, Erlih je to neposredno pokazao tako što je obojene preseke tretirao hloridom gvožđa, kao i vazduhom, i posmatrao povratak boje. Boja koja menja boju u zavisnosti od redoks stanja svog okruženja služi kao sonda za to okruženje.

Tako su se dva svojstva našla jedno uz drugo. Boja je mogla da razlikuje jedno tkivo od drugog. A boja se mogla uključivati i isključivati promenom oksidacionog stanja.

Posmatrano unazad, drugo svojstvo predstavlja početak hemioterapije. Ako se jedinjenje vezuje za jednu vrstu tkiva, a za drugu ne, onda bi isto jedinjenje moglo da dopre do jedne vrste organizma, a do druge ne. Erlih je zaključak izneo neposredno: ako se patogen može selektivno obojiti, bojenje bi moglo da ukazuje na specifično štetno delovanje na taj patogen. Boja bi zato mogla da se koristi kao lek, usmeren na uljeza, a ne na pacijenta.

Prvo ispitivanje kod pacijenta nije bilo za malariju. Godine 1890, zajedno sa psihijatrom Arturom Lepmanom, Erlih je izvestio da metilensko plavo ublažava bol kod neuralgičnih i reumatskih stanja mišića, zglobova i tetiva. Njih dvojica razmatrali su da li bi lek mogao da deluje na duševne bolesti i odlučili da ga ne isprobaju. Italijanski lekar Pjetro Bodoni iz Đenove ipak je to učinio. Njegov rad iz 1899. u naslovu govori o sedativnom delovanju kod različitih oblika psihoze: opisao je smirivanje četrnaest uznemirenih pacijenata i zabeležio da su drugi lekari u Đenovi već koristili boju u istu svrhu. Sedacija nije delovanje na bolest, a ta razlika se u ovoj istoriji stalno ponavlja.

Rad na malariji usledio je 1891, sa patologom Paulom Gutmanom, u bolnici Moabit u Berlinu. Metilensko plavo dato je dvojici pacijenata, a izveštaj je objavljen u časopisu Berliner klinische Wochenschrift od 28. septembra 1891. U prvom slučaju pacijent je uveče 29. juna odjednom uzeo 0.5 g boje; očekivani napad nije se u potpunosti razvio, a jedina kasnije zabeležena tegoba bila je blaga strangurija uz plavi urin. Napadi groznice nestali su tokom prvih dana, a parazita u krvi više nije bilo najkasnije do osmog dana. Sami autori zaključili su da su njihova očekivanja u potpunosti ispunjena. Dva slučaja bez kontrolne grupe nisu dokaz. Potpuniji prikaz metilenskog plavog i malarije, uključujući savremena ispitivanja, pripada zasebnoj stranici, a zanimljivo pitanje ovde je uže: koliko je Erlihovog obrazloženja izdržalo susret sa parazitom.

Gde je obrazloženje opstalo, a gde nije

Od predloženog mehanizma nije opstalo mnogo, bar ne u obliku koji je Erlih ponudio. Uredna verzija, u kojoj se pljosnati triciklični katjon uvlači između parova baza DNK parazita, ne izdržava proveru kod roda Plasmodium. Inficirani eritrocit tako lako redukuje metilensko plavo da ono uopšte ne stiže do parazita kao planarni katjon, pa objašnjenje interkalacijom koje odgovara akridinskim bojama ne odgovara ovoj.

Ono što dokazi podržavaju manje je uredno. Metilensko plavo inhibira glutation-reduktazu parazita pri koncentracijama koje se mogu postići kod pacijenta. Ono blokira pretvaranje hema u hemozoin, inertni pigment koji parazit stvara da bi izbegao trovanje proizvodima sopstvenog razlaganja hemoglobina, približno jednako efikasno kao hlorokin i daleko efikasnije od kinina. Njegovo redoks kruženje takođe stvara reaktivne kiseonične vrste u ćeliji koja ih već proizvodi. Koji je od ovih procesa stvarni mehanizam, ili da li svi doprinose, još nije razjašnjeno.

Postoji još jedna komplikacija, koja treba da utiče na čitanje svake istorijske tvrdnje o ovom jedinjenju. Komercijalno metilensko plavo iz tog perioda nije bilo jedna supstanca. Uzorci su sadržali Azure B, monodemetilovani srodni spoj, a u starijim rastvorima nakupljalo ga se više. Azure B je metahromatska boja sa drugačijim ciljnim strukturama: dvolančanu DNK boji tamnoplavo, a RNK zeleno. Mešavina dve boje sa različitim odredištima, u odnosima koje niko nije zabeležio, ne može da potkrepi jasnu tvrdnju o tome šta je metilensko plavo u njoj radilo.

Sama boja nikada nije potisnula kinin. Metoda je prošla bolje. Erlihov učenik Vilhelm Rel, radeći za koncern boja i lekova IG Farben, nastavio je da razvija derivate boja kao lekove za tropske bolesti i obezbedio alat koji je nedostajao: kanarinca zaraženog ptičjom malarijom, kao rutinski model za proveru potencijalnih jedinjenja. Verner Šuleman je zatim izmenio bočni lanac, a nastala fenotiazinijumska so izlečila je eksperimentalnu infekciju. Pacijenti su od nje i dalje postajali plavi.

Pokazalo se da trajni rezultat nije bila ni boja ni prstenasti sistem, već bočni lanac. Dodavanje dialkilaminoalkilamino grupe promenilo je ponašanje molekula, a taj fragment opstao je kroz svaku kasniju izmenu strukture. Ako se ta grupa zadrži, a fenotiazinijumski prsten zameni akridinskim, rezultat je kinakrin. Ako se uvede hinolinski prsten, rezultat je hlorokin. Pamakin, primakin i amodiakin, koji se i dalje nalaze među antimalarijskim lekovima, nose istu grupu. Jedinjenje koje nije uspelo kao terapija dalo je deo koji jeste.

Veza sa antipsihoticima vodi preko prstena, a ne preko leka. Razjašnjavanje strukture metilenskog plavog dovelo je Hajnriha Augusta Berntsena do osnovnog fenotiazinskog jezgra 1883, a upravo na toj osnovnoj strukturi, sa različitim supstituentima, hemičari u kompaniji Rhône-Poulenc radili su tokom 1940-ih tragajući za antihistaminicima. Jedno od tih jedinjenja sintetisano je pred kraj 1950. i ispitao ga je hirurg Anri Labori, koji je primetio da pacijente ostavlja mirnim i ravnodušnim. Njegova prva objavljena primena u psihijatriji, kod pacijenta sa manijom, usledila je u januaru 1952. Prvi antipsihotik nije toliko potomak Erlihovog antimalarijskog leka koliko daleki rođak boje od koje je počeo.

Tri navike koje vredi zadržati iz ove epizode

1. „Prvi sintetički lek korišćen u medicini“ opisuje kategoriju, a ograde su veće nego što izraz nagoveštava. Taj izraz postao je ustaljen; često citirani pregledni rad Širmera i saradnika u časopisu Neurobiology of Aging naziva metilensko plavo prvim potpuno sintetičkim lekom korišćenim u medicini. Hloral-hidrat uveden je kao sintetički sedativ 1869, više od dvadeset godina ranije. Sam rad iz 1891. daje deo odgovora, jer njegovi autori navode sintetičke antipiretike koji su već bili neuspešni protiv malarije, među njima hinolin, antipirin i antifebrin. Erlihov sopstveni lek na bazi arsena za sifilis pojavio se još kasnije. Odbranjiva verzija tvrdnje odnosi se na metodu, a ne na prvenstvo: metilensko plavo je među najranijim sintetičkim jedinjenjima izabranim da deluju protiv određenog organizma na osnovu hemijske teorije selektivnosti.
2. Selektivna raspodela nije selektivna korist. Erlihov rezultat iz 1886. bio je da boja dospeva u nervno tkivo. Gde jedinjenje dospeva i šta radi kada tamo stigne dva su različita merenja, a prvo je mnogo lakše sprovesti. U tom raskoraku od tada živi većina tvrdnji o metilenskom plavom i mozgu.
3. Čistoća pripada dokazima, a ne marketingu. Istorijski zapisi dvosmisleni su upravo iz tog razloga. Male strukturne razlike menjaju gde ovo jedinjenje dospeva, zbog čega sertifikat analize mora biti vezan za konkretnu seriju, a ne ponuđen kao opšta izjava da je proizvod ispitan. Prodavac koji tvrdi da proizvod odgovara farmakopejskoj monografiji, a ispituje samo teške metale, tvrdi više nego što izveštaj potkrepljuje. Blupreme nabavlja metilensko plavo od farmaceutskog proizvođača i ispituje punu specifikaciju navedenu u monografiji: identitet, čistoću, organske nečistoće, rezidualne rastvarače, elementarne nečistoće, ostatak nakon žarenja, mikrobiološke granice i bakterijske endotoksine. Izveštaj je objavljen uz proizvod, a stranica o metilenskom plavom USP kvaliteta objašnjava te granice i zašto prvo treba proveriti rezultat za Azure B.

Hronološki pregled izvora

Hronološki sled prekretnica, uključujući hemiju boja pre Erliha i stepene kvaliteta i specifikacije posle njega, izložen je zasebno u istoriji metilenskog plavog, a identitet samog jedinjenja obrađen je u tekstu šta je metilensko plavo.

Ilustracije na kojima se ovaj prikaz zasniva, reprodukovane u preglednom radu Krafts, Hempelmann i Skórska-Stania iz 2012, nisu jednako vredni izvori, a jedan primer pokazuje zašto. Prikaz iz 1891. primarni je zapis ispitivanja; portret iz 1910. pored njega datira ugled i ništa više. Stranice iz Andersagove beležnice iz 1934. neposredan su trag uvođenja hinolinskog prstena, zapisan rukom samog hemičara.

Pošten sažetak Erlihovih eksperimenata sa bojama glasi: bio je u pravu u pogledu selektivnosti i cilja, ali je pogrešio u pogledu mehanizma. Metilensko plavo zaista se koncentriše u nervnom tkivu i zaista šteti parazitu malarije. Drugo ne radi zbog prvog, a hemijsko objašnjenje koje je ponudio za oba bilo je pogrešno. Ono što je nesporno pokazao bilo je trajnije od tačnog mehanizma: jedinjenje se može izabrati umesto slučajno pronaći, i to na osnovu dokaza prikupljenih pre nego što ga iko da pacijentu.