Može li metilensko plavo da zaobiđe mitohondrijski kompleks III? Zašto se studije ne slažu

Dve laboratorije ispitivale su da li metilensko plavo može da zaobiđe blokirani mitohondrijski kompleks III. Jedna je odgovorila da ne može. Druga je odgovorila da može. Obe su imale podatke.

Prva studija, na mitohondrijama iz mozga miša, pokazala je da ova boja to ne može. Druga, na mitohondrijama iz mozga tri vrste glodara, pokazala je da delimično može. Treća studija, na jetri miša, često se navodi u istom kontekstu, ali je ispitivala nešto drugo. Kada joj se odredi pravo mesto, polovina zabune nestaje.

Ne može se proglasiti jedan univerzalni mehanizam. Postoje tri eksperimenta sa različitim blokatorima, dozama i merenim pokazateljima. Najpre pročitajte uslove. Zaključci proizlaze iz njih.

Šta ovde znači zaobilaženje

Elektroni ulaze u lanac preko kompleksa I (iz NADH) ili kompleksa II (iz sukcinata), prolaze kroz kompleks III do citohroma c, a zatim kroz kompleks IV do kiseonika. Gradijent koji se pritom stvara ćelija koristi za proizvodnju ATP-a.

Tvrdnja o zaobilaženju znači da metilensko plavo preuzima elektrone pre mesta blokade i predaje ih posle njega. Oksidovana boja prima elektrone od NADH ili ranih komponenti lanca, postajući leukometilensko plavo, a redukovani oblik ih predaje citohromu c ili vraća u lanac. Ako se predaja odvija posle mesta blokade, respiracija i membranski potencijal delimično se obnavljaju. Ako se odvija na mestu blokade ili pre njega, nema oporavka.

Jedan detalj kompleksa III presudan je za veliki deo ovog spora. U kompleksu se odvija Q-ciklus sa dva mesta vezivanja inhibitora. Antimicin se vezuje za mesto Qi. Miksotiazol se vezuje za mesto Qo. Studija koja koristi samo jedan od njih ispitala je samo polovinu kompleksa.

Prva studija: nema zaobilaženja u mitohondrijama iz mozga miša

Gureev i saradnici koristili su mitohondrije iz kore mozga miševa C57BL/6, izolovane digitoninom, i ispitivali ih pri koncentraciji od 0.1 mg proteina po ml. Supstrati su obuhvatali tri režima: piruvat i malat, svaki pri 5 mM, sukcinat pri 10 mM sa glutamatom pri 2 mM i L-prolin pri 10 mM. Blokatori su bili rotenon pri 1 micromolar (kompleks I) i antimicin pri 1 mikrogram po ml (kompleks III). Doze boje bile su 0.5, 1 i 2 micromolar, uz 1 micromolar kao glavnu koncentraciju. Metode i zapisi merenja nalaze se u kratkom radu u časopisu FEBS Letters.

Zaobilaženje kompleksa I bilo je uspešno. Rotenon je smanjio respiraciju stimulisanu ADP-om sa oko 121 na oko 2 nmol u minuti po mg, a boja pri 1 micromolar vratila ju je na oko 21. Membranski potencijal se obnovio uz piruvat i malat, kao i uz L-prolin.

Zaobilaženje kompleksa III nije bilo uspešno. Antimicin je smanjio respiraciju na oko 16, a boja ju je povećala samo na oko 20. Membranski potencijal nije se obnovio ni uz jedan supstrat, pri dozama boje do 5 micromolar. Podaci o peroksidu ukazivali su na isto: sama boja povećala je oslobađanje peroksida sa bazalne stope od približno 76 pmol u minuti po mg na približno 1170, 1460 i 1945 pri tri doze, dok je antimicin smanjio taj signal izazvan bojom za približno 25, 88 i 96 procenata, redom. Kada bi redukovana boja reagovala direktno sa kiseonikom, blokiranje kompleksa III ne bi trebalo da potisne signal. Autori su zaključili da se redukovana boja oksiduje na mestu Qo kompleksa III, pre mesta blokade antimicinom. Kratka petlja, opisno: donori predaju elektrone boji, boja ih predaje mestu Qo, a zatim se nastavlja uobičajenim putem. Rotenon se zaobilazi. Antimicin ne.

Druga studija: delimično zaobilaženje kod tri vrste, na oba mesta delovanja inhibitora

Svab i saradnici proširili su eksperimentalni plan. Koristili su mitohondrije iz mozga miševa, pacova i zamoraca, izolovane pomoću Percoll-a, ispitivane pri istih 0.1 mg po ml, uz piruvat i malat ili glutamat i malat, svaki pri 5 mM. Koristili su dva blokatora kompleksa III: antimicin A pri 0.3 micromolar i miksotiazol pri 1 micromolar. Boja je u većini testova bila pri 2 micromolar, a u ispitivanjima citohroma c pri 0.5. Sve tri vrste, ispitane usklađenim protokolima, obuhvaćene su radom sa otvorenim pristupom.

Obe blokade delimično su zaobiđene kod sve tri vrste. U mitohondrijama miša antimicin je potisnuo respiraciju, a boja ju je povećala za oko 60 procenata, sa približno 37 na 59 nmol u minuti po mg. Miksotiazol ju je potisnuo za 88 procenata, na oko 4.5, a boja ju je povećala petostruko, na oko 23. Membranski potencijal delimično se obnovio uz oba inhibitora, što je mereno pomoću dve boje (safranin O i ratiometrijski TMRM) kako bi se isključili optički artefakti.

Ovaj rad je direktno ispitao i predaju elektrona, što prva studija nije uradila. Egzogeni acetilovani citohrom c pri 25 micromolar nije bio redukovan u prisustvu energizovanih mitohondrija, sa inhibitorima ili bez njih, ali je dodavanje boje pokrenulo redukciju u oba slučaja. U puferu bez ćelija, NADH sa bojom redukovao je citohrom c brzinom proporcionalnom NADH. Duži prelaz, opisno: redukcioni ekvivalenti prelaze na boju, boja ih direktno predaje citohromu c, a kompleks IV kiseoniku. Taj put potpuno preskače kompleks III, pa se oba blokatora mogu zaobići.

Dva dodatna pokazatelja podržavaju ovo tumačenje. Fluorescencija NAD(P)H opala je kada je boja dodata mitohondrijama tretiranim miksotiazolom, što znači da su redukcioni ekvivalenti odlazili novim putem. Apsorbancija boje pri 660 nm pratila je svako dodavanje redom, dok su supernatanti nakon centrifugiranja pokazali da se oksidovana boja nakuplja unutar energizovanih mitohondrija više od stostruko, a zatim ih napušta kada potencijal kolabira. I protonski bilans se uklapa: preskakanje koraka pumpanja ostavlja približno 2 protona po paru elektrona umesto 10, pa je brža potrošnja kiseonika uz samo delimičnu repolarizaciju upravo ono što se očekuje od stvarnog zaobilaženja, a ne dokaz protiv njega.

Isti preparat dao je odgovore koji lako mogu navesti na pogrešan zaključak pri površnom čitanju. Uz inhibitor i boju, ADP je smanjivao respiraciju umesto da je povećava, a blokada transporta ju je stimulisala umesto da je usporava, dok se membranski potencijal i dalje menjao u uobičajenim smerovima. Sama potrošnja kiseonika u ovom sistemu navodi na pogrešan zaključak.

Treća studija: studija na jetri koja je ispitivala komplekse I i II, a ne III

Lee i Boelsterli koristili su mitohondrije iz jetre miša i kultivisane hepatocite oštećene efavirenzom (kompleks I, IC50 približno 30 micromolar) i hidrazinom, metabolitom izoniazida (kompleks II, IC50 približno 30 micromolar). Boja pri približno 30 micromolar obnovila je oksidaciju NADH, membranski potencijal i ATP, uz smanjenje oksidanasa i nekrotične ćelijske smrti. Rad u časopisu Redox Biology predstavlja model u kojem boja prenosi elektrone zaobilazeći oštećene komplekse I i II.

Taj rezultat predstavlja potvrđen kontekst za ranije delove lanca i ne govori ništa o kompleksu III, jer u njemu na tom mestu ništa nije bilo blokirano. Ne može ni da potvrdi ni da opovrgne bilo koju od dve studije na mozgu.

Matrica uslova

Četiri razloga zbog kojih obe studije kompleksa III mogu biti u pravu za sopstvenu eksperimentalnu postavku

1. Blokator nije predstavljao istu intervenciju. Sam antimicin pri 1 mikrogram po ml naspram antimicina pri 0.3 micromolar uz zaseban blokator mesta Qo. Put kojim boja dovodi elektrone do mesta Qo ne uspeva upravo tamo gde direktan put do citohroma c uspeva. Jedno mesto ne može predstavljati oba.

2. Doza boje i vreme merenja razlikovali su se. Glavne koncentracije bile su 1 naspram 2 micromolar, kod boje koja prolazi kroz redoks cikluse i čiji unos i direktna redukcija citohroma c zavise od koncentracije i vremena. Male razlike u dozi, uz različito vreme merenja, mogu otkriti različite grane iste mreže.

3. Preparati su se razlikovali. Izolacija digitoninom i izolacija pomoću Percoll gradijenta izdvajaju mitohondrijske populacije koje se preklapaju, ali nisu identične. Koncentracija proteina bila je usklađena na 0.1 mg po ml, pa ta promenljiva otpada, ali potpopulacija i očuvanost ne. A razlika u vrsti isključena je kao objašnjenje: druga grupa reprodukovala je svoj fenotip i kod miša.

4. Supstratni uslovi određuju šta boja može da uradi. Tri supstratna režima naspram parova povezanih sa NADH. Dostupnost NADH i membranski potencijal zajedno određuju koliko brzo se boja redukuje i gde se raspoređuje, a put koji zahteva redukovanu boju uz oksidovani citohrom c zavisi od tog izbora.

Kako čitati sledeću tvrdnju o zaobilaženju

Pitajte koji je kompleks blokiran, kojim inhibitorom, na kom mestu i pri kojoj dozi. Pitajte kolika je koncentracija boje i kada je merenje obavljeno. Pitajte koje su tkivo, vrsta, postupak izolacije, koncentracija proteina i supstrat korišćeni. I pitajte da li se potencijal, respiracija, redoks stanje i direktan test predaje elektrona slažu, jer je sama potrošnja kiseonika ovde više puta navela na pogrešan zaključak.

Uzak zaključak ostaje važeći. Zaobilaženje kompleksa I pomoću boje prihvaćeno je. Kod kompleksa III, mitohondrije miša sa antimicinom pri 1 mikrogram po ml i bojom pri 1 micromolar ne pokazuju funkcionalno zaobilaženje, dok tri vrste sa antimicinom pri 0.3 micromolar ili miksotiazolom pri 1 micromolar i bojom pri 2 micromolar pokazuju delimično zaobilaženje uz direktan prenos elektrona sa boje na citohrom c. Te tvrdnje mogu istovremeno biti tačne. Sve šire od toga predstavlja ekstrapolaciju.

Povezani tekstovi zadržavaju spornu tvrdnju u okvirima nesporne hemije: kako metilensko plavo prenosi elektrone za prenosni mehanizam, eksperimenti zaobilaženja kompleksa I za potvrđeni slučaj u ranijem delu lanca, merenja membranskog potencijala i njihovi artefakti za objašnjenje zašto su bile potrebne dve boje, kao i laboratorijsko rukovanje supstancama koje prolaze kroz redoks cikluse za zamke vezane za doziranje i vreme merenja.