Metilensko plavo i vid: šta pokazuju istraživanja mrežnjače i gde su njihove granice

Čitalac nailazi na studiju u kojoj je metilensko plavo zaštitilo mrežnjaču, pa postavlja prirodno pitanje: treba li ga stavljati u oko? Istraživanja metilenskog plavog i vida ne daju odgovor na to pitanje, jer nijedna od ključnih studija nije ispitivala takvu primenu. U jednoj je boja ubrizgana u staklasto telo miševa zajedno sa toksinom. U drugoj je dodata u medijum koji okružuje izolovane ćelije u laboratorijskoj posudi. U trećoj je dodata u vodu za piće miševa sa mutacijom. Svaki rezultat vezan je za svoj put primene i svoj model.

Ovaj članak razmatra tri pretkliničke studije, dva tipa ćelija mrežnjače i granicu između zaštite u laboratoriji i kliničkog lečenja oka. Obrazac je dosledan: metilensko plavo može da menja mitohondrijski stres u ćelijama mrežnjače u kontrolisanim uslovima, ali taj nalaz ne opravdava nanošenje maloprodajnih rastvora na oko.

Dva tipa ćelija, dve različite bolesti

Mrežnjača ima više slojeva, a važno je o kom sloju je reč. Svetlost prvo pada na fotoreceptore u spoljašnjem delu mrežnjače. Njihovi signali preko posredničkih neurona stižu do ganglijskih ćelija u unutrašnjem delu mrežnjače, čiji aksoni izlaze kroz vidni živac. Dijagram ispod prikazuje nazive slojeva redom.

Ganglijske ćelije mrežnjače su ćelije koje su ugrožene kod glaukoma i optičke neuropatije. Kada se u pretragama pominju metilensko plavo i glaukom, obično se misli na ovaj unutrašnji sloj i njegove aksone. Fotoreceptori su ćelije koje su ugrožene kod degeneracije spoljašnjeg dela mrežnjače. Oni imaju najveće energetske potrebe u mrežnjači i rade blizu granice svog respiratornog kapaciteta, zbog čega im ostaje malo rezerve kada mitohondrijski kompleks I zakaže. Rezultat dobijen na jednom tipu ćelija ne može se preneti na drugi, a tri studije u nastavku razmatraju ih odvojeno. Opšta veština razdvajanja modela od zaključaka objašnjena je u članku kako čitati istraživanja metilenskog plavog.

Ganglijske ćelije u oku živog miša

U najranijoj od ove tri studije, istraživači su napravili model optičke neuropatije mikroinjekcijom rotenona u staklasto telo jednog oka miša, dok je drugo oko služilo kao kontrola sa rastvaračem. Rotenon blokira mitohondrijski kompleks I, ulaznu tačku preko koje elektroni iz NADH prelaze dalje. Disfunkcija kompleksa I ujedno je osobina koja povezuje ovaj model sa Leberovom naslednom optičkom neuropatijom, bolešću ganglijskih ćelija i vidnog živca.

Dvadeset četiri sata kasnije, sloj ganglijskih ćelija u očima tretiranim rotenonom bio je tanji i sadržao je manje ćelija nego u kontrolnim očima. Kada je metilensko plavo ubrizgano zajedno sa rotenonom, to oštećenje je sprečeno u zavisnosti od doze, pri čemu je najveća ispitana doza (0.07 mg/kg, daleko ispod LD50 za miševe) očuvala i debljinu sloja i broj ćelija. Paralelna ispitivanja u homogenatima mozga pokazala su dva efekta: metilensko plavo poništilo je oksidativni stres izazvan rotenonom i pad potrošnje kiseonika. Autori su predložili ekscitotoksični mehanizam u kojem rotenon oštećuje modulatorne amakrine ćelije, ganglijske ćelije prekomerno stvaraju impulse, a antioksidativno delovanje prekida nastalo oštećenje. Predložena hemijska osnova te zaštite detaljno je opisana u članku mitohondrijski mehanizmi metilenskog plavog.

Ovaj rezultat ima tri ograničenja. Boja je ubrizgana zajedno sa toksinom direktno u oko, što predstavlja način dostave, a ne raspored lečenja. Period posmatranja trajao je 24 sata. I vrednosti izmerene za citohrom-oksidazu porasle su u obe grupe sa oštećenjem, što su autori protumačili kao prekomernu aktivnost, a ne kao dokaz obnovljene respiracije u živoj mrežnjači.

Ganglijske ćelije izolovane u laboratorijskoj posudi

Druga studija uopšte nije koristila celo oko. Istraživači su izolovali primarne ganglijske ćelije mrežnjače mladih pacova i izložili ih rotenonu, induktoru apoptoze staurosporinu ili niskom nivou kiseonika tokom 72 sata, a zatim su merili preživljavanje bojenjem za razlikovanje živih i mrtvih ćelija. Metilensko plavo u medijumu za kulturu, pri koncentracijama od 1 i 10 micromolar, poboljšalo je preživljavanje pri svakom od ovih štetnih uticaja, približno 1.5 do 1.9 puta, u zavisnosti od uslova. Prateće ispitivanje pokazalo je da je metilensko plavo očuvalo aktivnost citohrom c oksidaze tokom izlaganja vodonik-peroksidu.

Ovo je farmakologija izolovanih ćelija. Jedinjenje je do ćelija dospelo difuzijom kroz medijum za kulturu pri definisanoj koncentraciji, bez rožnjače, suznog filma, sočiva, staklastog tela, krvotoka ili imunskog sistema na tom putu. Upravo je ta jednostavnost svrha modela: on pokazuje da same ganglijske ćelije mogu biti zaštićene kada jedinjenje stigne do njih. Ne govori ništa o tome da li bi kap na površini rožnjače obezbedila bilo koju definisanu koncentraciju u unutrašnjem delu mrežnjače. Koncentracije iznad 10 micromolar izbegavane su zbog toksičnosti za iste te ćelije, što podseća da odnos doze i odgovora u laboratorijskoj posudi može ići u oba smera.

Fotoreceptori kod miševa sa mutacijom i u ćelijskoj liniji

Treća studija bavi se spoljašnjim delom mrežnjače. Istraživači su koristili miševe Harlequin, kod kojih nedostatak faktora koji indukuje apoptozu dovodi do nepotpunog sklapanja kompleksa I, i ispitivali strukturu fotoreceptora, markere spoljašnjih segmenata i integritet mitohondrija u uzrastu od 11 meseci. Metilensko plavo davano je sistemski, u vodi za piće nakon odbijanja od sisanja, u količini od oko 10 mg/kg dnevno. Tretirani miševi sa mutacijom zadržali su veću debljinu mrežnjače, više markera rodopsina i opsina i zdraviju strukturu mitohondrija nego netretirani miševi sa mutacijom.

Prateći rad na ćelijama koristio je ćelije 661W, imortalizovanu mišju ćelijsku liniju nalik fotoreceptorima, izloženu rotenonu sa metilenskim plavim ili bez njega tokom 24 sata. Preživljavanje se poboljšalo pri koncentraciji od 30 micromolar, a niže koncentracije normalizovale su odnos NADH prema NAD+ i smanjile oksidativni stres. Posebno se ističe ono što metilensko plavo nije uradilo: nije obnovilo ATP. Zaštita je pratila ublažavanje redoks stresa i smirivanje puteva odgovora na stres, uključujući mitohondrijski odgovor na nepravilno savijene proteine i markere mitofagije, a ne obnovu snabdevanja energijom.

Ta razlika je važna za tvrdnje o metilenskom plavom i mrežnjači. Jedinjenje može da održi fotoreceptor pod stresom u životu, a da ne otkloni njegov energetski deficit, što svaku terapijsku interpretaciju ograničava na redoks stres, a ne na opšte podmlađivanje.

Uporedni pregled tri studije

Poređenje u nastavku označava svaku studiju prema modelu i putu primene, jer upravo te dve kolone određuju šta rezultat može da potkrepi.

Svaki red odnosi se na pretkliničku studiju. Nijedna nije uključivala pacijente, merila vid niti ispitivala oftalmološku formulaciju.

Zašto ovo nije lečenje glaukoma

Lečenje glaukoma snižava intraokularni pritisak. Neuroprotekcija pokušava nešto drugo: da održi ganglijske ćelije i njihove aksone u životu pod stresom. Navedene studije pripadaju drugom cilju, a ne prvom. Nijedna nije snižavala pritisak i nijedna nije upoređivala metilensko plavo sa terapijom za snižavanje pritiska. Zato etablirani pristupi lečenju glaukoma i kontroli pritiska ostaju odvojeno pitanje od redoks neuroprotekcije i zato se rezultat o preživljavanju ćelija ne može tumačiti kao očuvan vid.

Razlike u putu primene dodatno potvrđuju to ograničenje. Istovremena intravitrealna injekcija postavlja poznatu količinu uz mrežnjaču u trenutku oštećenja. Primena kroz vodu za piće izlaže celu životinju tokom više meseci, uz nepoznatu koncentraciju u mrežnjači. Medijum za kulturu direktno izlaže same ćelije. Nijedan od ovih postupaka ne predviđa koji bi deo lokalno primenjene doze prošao kroz rožnjaču, izbegao uklanjanje suzama, prošao kroz sočivo i staklasto telo i stigao do bilo kog sloja mrežnjače u korisnoj koncentraciji. Taj problem dostave deo je šireg pitanja puteva primene i raspodele metilenskog plavog, gde svaki put primene zahteva sopstvena merenja koncentracije.

Razlike između tkiva predstavljaju drugu prepreku. Boja koja stigne do prednjeg dela oka nije stigla do njegovog zadnjeg dela, a koncentracija koja pomaže jednom sloju može da ošteti drugi. Maloprodajni rastvori nisu proizvedeni, sterilisani, puferisani niti konzervisani kao oftalmološki preparati, a čistoća, pH, osmolalnost i pomoćne supstance važni su za izlaganje rožnjače i unutrašnjosti oka. Ništa u ovim nalazima na mrežnjači ne potvrđuje opravdanost stavljanja takvih rastvora u oko ili na njega. Pitanja o standardima pripreme pripadaju temi bezbednosti i rukovanja metilenskim plavim.

Gde se dokazi završavaju

Posmatrana zajedno, tri rada potkrepljuju usku tvrdnju: u kontrolisanim uslovima metilensko plavo može da ublaži mitohondrijski redoks stres u neuronima mrežnjače i očuva njihovu strukturu. Tvrdnja važi samo u granicama tih uslova. Modeli zasnovani na toksinu i genetskom poremećaju kompleksa I nisu glaukom, druze niti dijabetičko oboljenje. Kratki periodi posmatranja i strukturni ishodi nisu dugoročno očuvan vid. A zaštitna koncentracija u jednom odeljku nije doza za drugi.

Za snažniju potvrdu bili bi potrebni zasebni elementi: definisano izlaganje mrežnjače nakon klinički primenljivog puta primene, funkcionalni ishodi vida kod životinja, korist nezavisna od pritiska u modelu relevantnom za glaukom, a zatim podaci o bezbednosti i efikasnosti kod ljudi. Dok to ne postoji, veza između metilenskog plavog i vida ostaje istraživačka hipoteza sa jasnim granicama: verodostojna mitohondrijska farmakologija u mrežnjači, pokazana samo na ćelijama i životinjama, bez puta od ovih studija do lečenja očiju.