Metilensko plavo, tau i amiloid: zašto se mehanizmi uklanjanja proteina razlikuju

Pitajte šta metilensko plavo radi proteinima povezanim sa Alchajmerovom bolešću i čućete jedan samouveren odgovor tamo gde bi trebalo da čujete tri odgovora sa jasno navedenim ograničenjima. U epruveti ometa vezivanje tau proteina za druge molekule tau proteina. U jednom modelu miša smanjuje rastvorljivi amiloid, dok tau ostaje nepromenjen. U drugom smanjuje aktivnost enzima koji uopšte omogućava stvaranje amiloida. Svaki od ovih nalaza je stvaran. Nijedan ne predstavlja celu sliku i ne javljaju se svi u istoj životinji u isto vreme. Ovaj članak ih razdvaja kako se rezultat jednog eksperimenta više ne bi navodio kao dokaz za drugi.

Čitaoci koji žele širu sliku o tome kako metilensko plavo deluje unutar ćelija treba da počnu od tog pregleda. Čitaoci koje zanima da li je išta od ovoga pomoglo pacijentima treba da pročitaju pregled kliničkih nalaza kod Alchajmerove bolesti, jer tamo pripadaju ishodi ispitivanja na ljudima. Ovaj članak ne ponavlja taj pregled.

Nalaz o tau proteinu pripada testovima agregacije

Najstarija od ove tri priče potiče iz istraživanja tau proteina bez prisustva ćelija. Tau je protein koji formira neurofibrilarna klupka. U testu vezivanja tau-tau, fragmenti tau proteina udružuju se u uparene helikalne filamente, a fenotiazinske boje, uključujući metilensko plavo, sprečavaju to udruživanje pri niskim mikromolarnim koncentracijama. Kasnija biohemijska istraživanja pružila su hemijsko objašnjenje: boja oksiduje cisteinske ostatke na tau proteinu, što stabilizuje monomerni oblik i suzbija nastanak fibrila koji bi inače rasli. Prijavljene koncentracije koje inhibiraju agregaciju tau proteina kreću se približno od jednocifrenih do nižih dvocifrenih mikromolarnih vrednosti, što je raspon važan za sve što sledi.

Obratite pažnju na vrstu ove tvrdnje. Ona ne govori ništa o stvaranju tau proteina, fosforilaciji tau proteina u živom mozgu ili njegovom uklanjanju. Govori da u definisanim uslovima u epruveti oksidovana boja sprečava međusobno slaganje molekula tau proteina. To je precizan, ograničen i koristan rezultat. Problem nastaje kada se proširi u opštu tvrdnju da metilensko plavo uklanja patološke promene povezane sa tau proteinom, jer podaci iz eksperimenata na životinjama ne podržavaju tu verziju.

Nalaz o proteasomu pripada miševima 3xTg-AD i pokazuje različite ishode za amiloid i tau

Eksperiment koji najjasnije pokazuje razdvajanje ishoda jeste 16-nedeljna studija ishrane kod miševa sa tri mutacije povezane sa Alchajmerovom bolešću. Životinje su od uzrasta od šest meseci jele hranu koja je sadržala metilensko plavo, a istraživači su istovremeno merili tri stvari: proteasom, nivoe amiloida i tau.

Aktivnost proteasoma se promenila. Aktivnost slična himotripsinu porasla je za približno četvrtinu, a aktivnost slična tripsinu za približno polovinu, dok se treća katalitička aktivnost nije značajno promenila. Rastvorljivi amiloid-beta 40 i 42 smanjili su se svaki za približno četvrtinu. Autori su ovo protumačili kao pojačano uklanjanje, a ne smanjeno stvaranje, jer se prekursorski protein i fragmenti nastali njegovom obradom nisu promenili, dok su se učenje i pamćenje poboljšali u probnom testu u vodenom lavirintu.

Zatim dolaze razlike među ishodima. Nerastvorljivi amiloid se nije promenio. Bojenje kojim se prikazuju plakovi nije pokazalo promenu. Ukupni humani tau i fosfo-tau na treoninu 181 nisu se promenili, kao ni nepravilna lokalizacija tau proteina. Ni mitohondrijski parametri nisu se promenili: nije bilo značajnog efekta na aktivnost citohrom-c oksidaze, količinu proteina te oksidaze ili ATP. Dakle, u ovom modelu i pri ovom režimu primene, metilensko plavo povećalo je dve od tri aktivnosti proteasoma, smanjilo rastvorljivi amiloid, popravilo jedan bihevioralni pokazatelj i ostavilo nepromenjenim ishode vezane za tau, nerastvorljivi amiloid i ispitane mitohondrijske ishode.

Jedna napomena dodatno izoštrava zaključak umesto da ga oslabi. Ovi miševi u ispitivanom uzrastu još nisu razvili agregate tau proteina, pa eksperiment ne može pokazati da metilensko plavo ne deluje na tau klupka. Pokazuje da rastvorljivi amiloid može da se smanji dok se mereni ishodi vezani za tau ne menjaju, što je upravo vrsta rezultata u kojem se jedan protein promenio, a drugi nije, potrebna za ovu temu. Ako ste došli sa uverenjem da aktivacija proteasoma metilenskim plavim istovremeno uklanja oba karakteristična proteina, ova studija ispravlja to uverenje.

Nalaz o stvaranju amiloida pripada starim miševima PSAPP i protivreči prethodnom mehanizmu

Druga istraživačka grupa, drugi model i suprotno objašnjenje ranijeg koraka u procesu. U tromesečnoj studiji primene gastričnom sondom kod miševa PSAPP starih 15 meseci, dnevna oralna doza od 3 mg/kg smanjila je opterećenje plakovima u različitim regijama mozga za približno trećinu do polovinu i snizila nekoliko frakcija amiloida, uključujući oligomere merene posebnim testom. Međutim, ovde je predloženi mehanizam bio smanjeno stvaranje, a ne brže uklanjanje: količina proteina BACE1 u mozgu se smanjila, smanjio se i njegov proizvod C99, dok se informaciona RNK nije promenila. To ukazuje na efekat na nivou proteina, a ne na smanjenu ekspresiju gena.

Istraživanja na ćelijama dodatno su potkrepila ovaj zaključak. U testu bez ćelija sa rekombinantnim enzimom, metilensko plavo direktno je inhibiralo BACE1, a u ćelijama jajnika hrčka koje eksprimiraju humani amiloidni prekursorski protein, izlučeni amiloid 40 i 42 smanjili su se već pri koncentracijama od 1.56 mikromolara, dok je sam prekursor ostao nepromenjen. Uporedite to sa prethodnom studijom, u kojoj su fragmenti nastali obradom prekursora ostali nepromenjeni, a efekat je pripisan uklanjanju. Oba nalaza ne mogu opisivati isti univerzalni mehanizam, jer se modeli, uzrasti, doze, putevi primene i trajanja razlikuju. Upravo je to suština. Efekti metilenskog plavog na amiloid u jednoj eksperimentalnoj postavci ostvaruju se preko stvaranja, a u drugoj preko uklanjanja, pa navođenje bilo kog nalaza bez njegove postavke dovodi u zabludu.

Jedna hemija, više meta: veza preko oksidacije cisteina

Treći pravac istraživanja objašnjava kako se ista redoks hemija može pojaviti u pričama o međusobno nepovezanim proteinima. U biohemijskoj studiji inhibicije kaspaza, metilensko plavo inaktiviralo je kaspazu-6 oksidacijom njenog katalitičkog cisteina u sulfensku kiselinu, što je potvrđeno masenom spektrometrijom, pri koncentraciji za polumaksimalni efekat blizu 10.6 mikromolara. Kaspaza-3 bila je inhibirana pri sličnoj koncentraciji. Autori su ovo izričito povezali sa literaturom o tau proteinu: ista hemija oksidacije cisteina, predložena kao način održavanja tau proteina u monomernom obliku, može inaktivirati cisteinsku proteazu, a efektivne koncentracije se preklapaju.

Ovo je elegantno objašnjenje, ali i upozorenje. Redoks-aktivan molekul koji oksiduje izložene cisteine imaće više od jedne mete pri svakoj koncentraciji pri kojoj je aktivan. Priča o razgradnji agregata tau proteina, priča o kaspazama i moguće druge priče dele istu hemijsku radnju, ali različite objekte te radnje. Ta zajednička radnja ne čini nalaze međusobno zamenljivim. Ona znači da doza i kontekst određuju koja je meta važna i da hronična primena usmerena na jedan proces zavisan od cisteina može uticati i na druge, na šta su autori studije o kaspazama direktno ukazali. Povezana pitanja o tome kako redoks hemija metilenskog plavog određuje njegove mete, šta aktivacija proteasoma znači za druge agregirane proteine i da li dugotrajna primena menja profil meta zaslužuju zasebnu obradu.

Mehanizmi prema ishodima: koji nalaz pripada kom modelu

Čitajte tabelu red po red i pouka je jasna. Nijedan red ne pokazuje promenu u svakoj koloni. Najsnažniji rezultat o stvaranju amiloida potiče iz studije koja nikada nije ispitivala proteasom. Najsnažniji rezultat o proteasomu potiče iz studije u kojoj se obrada prekursora uopšte nije promenila. Nalaz o tau proteinu uglavnom potiče iz epruveta i hemije koju deli sa enzimima van predviđene mete. Svako ko spoji ove kolone u jednu tvrdnju, da metilensko plavo uklanja patološke proteine kao klasu, piše pregled eksperimenta koji nikada nije sproveden.

Ta disciplina važi i za pacijente. Da li ovi mehanizmi zajedno donose kliničku korist zasebno je pitanje, sa sopstvenim ispitivanjima i zaključcima, a odgovor se nalazi u kliničkim dokazima za Alchajmerovu bolest, a ne ovde.