Metilensko plavo i starenje skeleta: zašto nalazi na ćelijama nisu predvideli ishode na kostima miševa

Zamislite jedinjenje koje smiruje upravo one ćelije koje razgrađuju kost, ispitano u laboratorijskoj posudi, gde deluje baš kako se očekivalo. Manje višejedarnih osteoklasta, jasan odgovor zavisan od doze i uverljivo objašnjenje zasnovano na mitohondrijama. Zatim se isto jedinjenje daje miševima tokom većeg dela njihovog odraslog života, njihovi skeleti se snimaju u tri dimenzije i nema nikakve razlike. Stare kosti izgledaju staro, bez obzira na tretman.

To je veran prikaz jedne studije iz 2024, koju vredi precizno razumeti jer se nalazi baš na mestu gde većina tvrdnji o suplementima za kosti pada na ispitu. Rad su objavili Poudel i saradnici u časopisu Aging u martu 2024, uz otvoreni pristup, pa se svako merenje navedeno u nastavku može proveriti u izvoru. Njegov glavni nalaz jeste odsustvo efekta. Takvi rezultati nisu neuspesi. Oni su odgovori, a ovaj dobro odgovara na usko pitanje: da li dugotrajni sistemski antioksidativni tretman metilenskim plavim ili mitohinonom čuva skelet miša koji stari? Ne.

Kako starenje kostiju izgleda u brojkama

Gubitak kosti usled starenja nije samo jedna pojava, pa studija nije merila samo jednu stvar. Koristeći mikrokompjuterizovanu tomografiju, istraživači su snimili tri mesta u skeletu: kortikalnu kost na sredini dijafize butne kosti (njen gusti središnji deo), trabekularnu kost u distalnoj metafizi butne kosti (sunđerastu mrežu blizu zgloba) i trabekularnu kost u petom slabinskom pršljenu. Na svakom mestu zabeležili su standardne parametre mikroarhitekture. BV/TV označava udeo zapremine koji čini kost, a ne prostor koštane srži. BMD označava mineralnu gustinu. Tb.Th, Tb.N i Tb.Sp opisuju debljinu, broj i razmak trabekula. Debljina kortikalne kosti i površine poprečnog preseka opisuju dijafizu.

Zamislite trabekularnu kost kao potpornu konstrukciju unutar skladišta. Starenje potpuno uklanja neke potpore, a ostale stanjuje, pa opada udeo prostora ispunjen konstrukcijom, preostale potpore postaju udaljenije jedna od druge, a čitav okvir podnosi manje opterećenje. Kortikalna kost je sam zid skladišta, koji postaje tanji. Tretman koji štiti skelet trebalo bi da se odrazi na ove brojke. Upravo to je studija proveravala.

Šta se dogodilo u laboratorijskoj posudi

U ćelijskom delu istraživanja korišćena je koštana srž uzeta iz butnih i golenjačnih kostiju miševa UM-HET3 starih 6 do 7 meseci, genetički raznovrsnog soja uzgojenog za istraživanja starenja. Dobijena su četiri nalaza koji upućuju u različitim smerovima, pa svaki zahteva zasebno objašnjenje.

Prvo, mezenhimske matične ćelije, populacija koja obuhvata buduće ćelije koje stvaraju kost, ostale su vijabilne tokom 48 sati pri koncentracijama metilenskog plavog i mitohinona od 0.125 do 0.5 mikromola po litru. Nije bilo ni toksičnosti ni poboljšanja. Drugo, kada su te matične ćelije podstaknute da postanu osteoblasti u osteogenom medijumu i obojene radi otkrivanja alkalne fosfataze 18. dana, nijedno jedinjenje nije promenilo ishod ni pri jednoj ispitanoj koncentraciji. Ćelije koje stvaraju kost u posudi nisu reagovale.

Treće, ćelije koje resorbuju kost jesu reagovale. Prekursori iz koštane srži stimulisani pomoću M-CSF i RANKL, standardnog postupka za stvaranje osteoklasta, formirali su manje TRAP-pozitivnih višejedarnih ćelija kako je koncentracija rasla, uz jasno smanjenje iznad 0.25 mikromola po litru, odnosno pri najvišoj ispitanoj koncentraciji od 0.5. To je nalaz koji pokreće hiljadu optimističnih sažetaka, i on jeste stvaran u svojim granicama: direktna, neprekidna izloženost u kulturi potisnula je stvaranje osteoklasta na način zavisan od doze.

Četvrto, zreli osteoblasti izloženi tokom 48 sati i ispitani testom mitohondrijskog stresa nisu pokazali značajnu promenu bazalne ili maksimalne potrošnje kiseonika ni uz jedno jedinjenje. Pri 0.5 mikromola po litru činilo se da oba blago smanjuju respiraciju, ali promena nije dostigla statističku značajnost. Dakle, nalazi iz posude nisu pokazali oporavak mitohondrijske funkcije u ćelijama koje stvaraju kost, koji bi pratio efekat na osteoklaste. Predloženi mehanizam, poboljšanje energetskih procesa preko mitohondrijskog lanca transporta elektrona, nije doveo do merljivog povećanja respiracije tamo gde su ga istraživači tražili.

Šta se dogodilo kod miševa

Usledila su dva eksperimenta na životinjama, veoma različitog obima.

Manji je koristio ženke inbred soja C57BL/6J, standardnog soja u biomedicinskim istraživanjima. Počevši od uzrasta od 18 meseci, što je za miša približno kasno srednje doba, polovina je pila vodu koja je sadržala metilensko plavo u koncentraciji od 250 mikromola po litru tokom 6 ili 12 meseci, do uzrasta od 24 ili 30 meseci. Netretirane ženke stare 18 meseci dale su početne referentne vrednosti, a ženke stare 5 meseci pokazale su kako izgleda mlada kost. Starenje je učinilo upravo ono što starenje čini. U pršljenu L5, zapreminski udeo kosti opao je za oko 35 procenata, mineralna gustina za oko 18 procenata, a broj trabekula približno se prepolovio, bez obzira na tretman. Debljina kortikalne kosti opala je za oko 10 procenata između 18 i 24 meseca i za oko 30 procenata do 30 meseci. Metilensko plavo nije promenilo nijednu od tih krivih.

Veći eksperiment sproveden je u okviru Programa ispitivanja intervencija Nacionalnog instituta za starenje, koji ispituje potencijalna jedinjenja na miševima UM-HET3 oba pola u tri istraživačka centra. Metilensko plavo u koncentraciji od 28 delova na milion u hrani i mitohinon u koncentraciji od 100 delova na milion davani su od ranog odraslog doba do uzrasta od oko 22 do 24 meseca. Ista tri mesta u skeletu snimljena su mikro-CT metodom. Objavljena tabela prikazuje svaki parametar prema polu i tretmanu, uz prilagođenu statističku analizu, a kolona za tretman svuda govori isto: nema značajnog efekta, nema interakcije između tretmana i pola, ni na jednom mestu. Kortikalna ili trabekularna kost, butna kost ili kičma, mužjak ili ženka, metilensko plavo ili mitohinon. Skelet je stario svojim uobičajenim tokom.

Uporedna tabela koja povezuje oba dela istraživanja

Ovo je osnova na kojoj počiva ceo članak. Svaki red uparuje ono što je pokazala kultura sa onim što je pokazala životinja za isti biološki proces, koristeći merenja iz same studije.

Kada se čita red po red, tabela razrešava paradoks. Samo jedan od četiri ćelijska procesa reagovao je, i to samo blizu gornje granice ispitanog raspona, uz neprekidnu direktnu izloženost. Sve ostalo u posudi već je pokazivalo odsustvo efekta. Rezultat kod životinja zato manje liči na protivrečnost, a više na potvrdu: tri nalaza bez efekta i jedan uslovni efekat u kulturi pretvorili su se u odsustvo efekta po svim parametrima kod životinja.

Struktura kosti nije životni vek

Jedna zabuna zaslužuje zaseban odeljak, jer za metilensko plavo zaista postoje podaci o životnom veku, koje je lako pogrešno protumačiti kao podatke o kostima. U ranijoj kohorti Programa ispitivanja intervencija, metilensko plavo u istoj dozi u hrani povećalo je 90. percentil životnog veka ženki UM-HET3 za oko 6 procenata: efekat na preživljavanje u kasnom životnom dobu, bez promene medijane životnog veka i bez efekta kod mužjaka. Mitohinon nije pokazao efekat na životni vek ni kod jednog pola. Ti podaci o preživljavanju potiču iz objavljenih podataka programa o dugovečnosti, a ne iz rada o kostima.

Doprinos rada o kostima jeste u tome što ove evidencije drži odvojenim. Jedinjenje može promeniti preživljavanje u kasnom životnom dobu kod jednog pola, a da pritom ne očuva nijednu merenu osobinu skeleta. Podaci o preživljavanju obuhvataju smrti od svih uzroka; mikro-CT broji potpore u pršljenu. Ne postoji pravilo da intervencija mora delovati preko kosti da bi produžila život, a ova studija je direktan dokaz da je signal metilenskog plavog u kasnom životnom dobu kod ženki išao nekim drugim putem. Svako ko navodi nalaz o životnom veku kao podršku metilenskom plavom za osteoporozu koristi sredstva s pogrešnog računa. Opšti princip razdvajanja ovih evidencija objašnjen je u članku kako čitati istraživanja o metilenskom plavom.

Zašto kultura nije predvidela ishod kod miša

Pet objašnjenja uklapa se u podatke i ona se međusobno ne isključuju.

Prvo je izloženost. Ćelije u kulturi bile su neprekidno uronjene u rastvor poznate koncentracije. Miševi su mesecima jeli hranu sa dodatim jedinjenjem, a studija nije merila ni nivoe tih supstanci u koštanoj srži ni bilo koji marker oksidativnog oštećenja u kostima. Koncentracija koja potiskuje osteoklaste pri direktnoj primeni možda nikada ne dospe do prekursora u koštanoj srži na tom nivou. Rad je ispitivao jednu dozu po jedinjenju in vivo, pa odnos doze i odgovora kod životinja ostaje nepoznat.

Drugo je hemija. Reaktivne vrste kiseonika ne čine jednu ravnomerno izmešanu celinu unutar ćelije. Deluju u malim odeljcima tokom kratkih vremenskih intervala, a mitohondrijski, citosolni i membranski redoks sistemi ponašaju se delimično nezavisno. Mitohinon je osmišljen tako da se koncentriše u mitohondrijama, dok oksidativni signali koji pokreću stvaranje osteoklasta mogu nastati drugde. Smanjenje jedne lokalne populacije reaktivnih vrsta ne mora ponoviti ono što postiže neprekidno izlaganje cele ćelije.

Treće je spregnutost. U živoj kosti resorpcija i stvaranje su povezani: osteoklasti i susedne ćelije emituju signale koji privlače ćelije koje stvaraju kost na upravo resorbovano mesto. Potiskivanje stvaranja osteoklasta ne dodaje jednaku količinu kosti, jer može ukloniti i signale koji pozivaju graditelje. Posuda koja sadrži samo prekursore ne može pokazati ovu povratnu spregu. Skelet je ne može sakriti.

Četvrto je opterećenje. Osteociti registruju mehaničku deformaciju i podešavaju ravnotežu remodelovanja cele kosti. Kako životinje stare i manje se kreću, mehanički signal slabi, a gubitak sledi bez obzira na skroman farmakološki uticaj na jedan tip ćelija. Sami autori navode vežbanje i opterećenje koje podstiče izgradnju kosti kao verovatnije načine uticaja, što je taktičan način da se kaže da skelet više sluša fiziku nego redoks hemiju.

Peto je trenutak početka, uz jednu ogradu. U eksperimentu sa C57BL/6J tretman je počeo sa 18 meseci, kada je već došlo do znatnog gubitka strukture, a nijedno antiresorptivno sredstvo ne može ponovo izgraditi trabekule koje su perforirane i uklonjene bez odgovarajućeg podsticaja za stvaranje kosti. Ali vreme početka ne može objasniti sve, jer je davanje u Programu ispitivanja intervencija počelo u ranom odraslom dobu, a ipak ništa nije promenilo. Kasni početak objašnjava deo jednog eksperimenta. Ne objašnjava ništa u drugom.

Šta ovo znači za tvrdnje o metilenskom plavom i osteoporozi

Za čitaoca koji procenjuje metilensko plavo za zdravlje kostiju ili starenje skeleta, praktičan zaključak je kratak. Najbolji dostupni dugoročni dokazi kod miševa ne pokazuju korist za skelet od hronične primene metilenskog plavog ili mitohinona, uprkos stvarnom signalu potiskivanja osteoklasta u kulturi. Literatura o životnom veku pripisuje metilenskom plavom skroman efekat u kasnom životnom dobu samo kod ženki, a ova studija pokazuje da taj efekat nije ostvaren preko kostiju. Nijedna od ovih evidencija ne podržava primenu kod ljudi za osteoporozu, a podaci o kostima kod ljudi uopšte nisu deo ove slike. Pitanja doziranja i bezbednosti proizvoda kod ljudi pripadaju temi bezbednosti i neželjenih efekata metilenskog plavog, a ne ovom skeletu miša.

Dublja pouka tiče se redosleda dokaza. Ćelijski rezultat govori o tome šta jedinjenje može da uradi jednom tipu ćelija pri kontrolisanoj izloženosti. Rezultat na kostima govori o tome šta meseci sistemske izloženosti rade organu koji povezuje dva tipa ćelija pod mehaničkom kontrolom. U prvom se rađaju hipoteze. U drugom je, kada je reč o starenju skeleta i ova dva antioksidansa, ova hipoteza ugašena.