Metilensko plavo kod povrede mozga: razumevanje pretkliničkih dokaza

Udarac u glavu, začepljena arterija i spora neurodegenerativna bolest mogu završiti istim problemom: mozak više nema dovoljno energije da obavlja svoj posao. Taj zajednički ishod objašnjava zašto se jedno jedinjenje stalno pojavljuje u sve tri oblasti naučne literature. Ali zajednički ishod ne znači i zajednički koncept. Tretman primenjen pre povrede, tretman primenjen u prvom satu nakon nje i tretman čiji se rezultati mere mesecima kasnije ispituju različite ideje, čak i kada špric sadrži istu plavu tečnost.

Ovaj članak prati deo te literature koji se bavi povredama. Razmatra šta primena metilenskog plavog kod povrede mozga znači u eksperimentima na životinjama, razdvaja traumatsku povredu od moždanog udara i hronične neurodegeneracije i pokazuje zašto vreme primene doze objašnjava većinu razlika između studija.

Tri povrede, jedan energetski zastoj

Mehanizam koji povezuje ove modele nalazi se unutar mitohondrija. U normalnim uslovima elektroni prolaze kroz lanac transporta elektrona kako bi se proizveo ATP, a zdrav lanac drži reaktivne vrste kiseonika pod kontrolom. Nakon povrede, delovi lanca posustaju, proizvodnja ATP-a opada, a stvaranje slobodnih radikala raste. Pregledni rad iz 2018. u časopisu Molecular Neurobiology opisuje metilensko plavo kao alternativni prenosilac elektrona: ono prihvata elektrone iz NADH i prenosi ih na citohrom c, što povećava aktivnost kompleksa IV i obnavlja sintezu ATP-a čak i kada je početni deo lanca oštećen.

Prijavljeni brojevi su konkretni. U preparatima ćelija i tkivnih preseka aktivnost kompleksa IV porasla je za 30 do 100 procenata, dok je potrošnja kiseonika rasla uporedo, što ukazuje na to da su dodatni elektroni obavljali koristan rad umesto da izlaze iz lanca u obliku radikala. U modelu moždanog udara kod pacova, proizvodnja ATP-a u zahvaćenoj regiji bila je oko 30 procenata veća 24 sata nakon tretmana nego kod netretiranih životinja. Pregledni rad iz 2022. u časopisu Biochemistry (Moscow) navodi i posledične efekte: manje oksidativnog stresa, manje neuroinflamacije, manje apoptoze, kao i efekte na monoamin-oksidazu, sintazu azot-monoksida, mitohondrijsku biogenezu, autofagiju i agregaciju nepravilno savijenih proteina.

Dakle, koncept je jednostavan. Povreda blokira normalan put elektrona, a metilensko plavo nudi zaobilazni put. Sve što sledi svodi se na pitanja o kojoj je povredi reč, kada je jedinjenje dato i kako su rezultati mereni.

Traumatska povreda nije moždani udar

U modelu traumatske povrede mozga sila deluje odjednom. Primarno oštećenje je mehaničko: tkivo se kida, krvni sudovi pucaju, a krvno-moždana barijera postaje propustljiva u roku od nekoliko minuta. Ono na šta bi metilensko plavo moglo da utiče jeste sekundarni talas koji sledi tokom narednih sati i dana, kada mitohondrije u preživelom tkivu otkazuju, upala se širi, a edem raste. Ishodi praćeni u ovim studijama odražavaju taj sled: zapremina lezije, sadržaj vode u mozgu, preživljavanje neurona u blizini mesta udarca i kasnije ponašanje, poput motoričkog oporavka ili učenja u lavirintu.

U modelu moždanog udara ili globalne ishemije obrazac oštećenja je drugačiji. Protok krvi se zaustavlja, energetski zastoj nastupa u roku od nekoliko minuta, a ponovno uspostavljanje protoka donosi zasebno reperfuziono oštećenje. Ovde je primena usklađena sa događajem u krvnom sudu, često u roku od nekoliko minuta od okluzije ili reperfuzije, a ishodi kvantifikuju neposrednu sudbinu tkiva tokom nekoliko sati do jednog ili dva dana: veličinu infarkta, protok krvi i rani funkcionalni oporavak. Jedan obrazac u literaturi o moždanom udaru jeste prethodni tretman, odnosno davanje jedinjenja životinjama pre okluzije krvnog suda, čime se ispituje prevencija na način koji nijedan eksperiment sa traumom glave ne može etički da ponovi kod ljudi.

Rezultati kod moždanog udara najjači su u literaturi o povredama, a među njima je i najjasniji nalaz bez efekta. Pacovi kojima je metilensko plavo dato pri reperfuziji nakon jednog sata okluzije srednje moždane arterije imali su 30 procenata manje infarkte 2. dana, uz veći obim očuvanog ugroženog jezgra i penumbre (Shen, 2013). Studija sa trajnom okluzijom utvrdila je sporije napredovanje ugroženog tkiva ka infarktu, ali bez smanjenja konačne zapremine infarkta nakon 24 sata pri bilo kojoj od dve ispitane doze (Rodriguez, 2014). Treća studija okluzije smanjila je veličinu infarkta približno za polovinu pri srednjoj dozi i direktno dokumentovala ultrastrukturu mitohondrija i mitofagiju u ishemičnom mozgu, uz naizgled protivrečan detalj da je izmerena apoptoza rasla dok je nekroza opadala (Di, 2015). A kod globalne ishemije, kontinuirana infuzija niske doze obnovila je aktivnost citohrom c oksidaze, nivoe ATP-a i potencijal mitohondrijske membrane u osetljivoj CA1 regiji hipokampusa, očuvala te neurone i zaštitila prostornu memoriju (Lu, 2016). Vredi se zadržati na tom merenju u CA1 regiji: reč je o direktnim podacima o ATP-u i respiratornom lancu iz povređenog mozga, o kojima literatura o TBI uglavnom zaključuje posredno umesto da ih meri.

Hronična neurodegeneracija razlikuje se od oba slučaja. U modelima Alchajmerove, Parkinsonove i Hantingtonove bolesti životinje dobijaju jedinjenje nedeljama ili mesecima, a mere se agregacija proteina, procesi povezani sa dopaminom ili postepeno kognitivno propadanje. Ti ishodi imaju vrlo malo zajedničkog sa lezijom izmerenom nekoliko dana nakon udarca. Čitaoci koji prenose rezultat iz jedne kategorije u drugu prenose nalaz preko granice koju eksperimenti nikada nisu prešli. Naš vodič kroz literaturu o neurodegeneraciji zadržava te dugotrajne studije u njihovom sopstvenom okviru, a poređenje sa dokazima koji se odnose samo na moždani udar detaljno razdvaja eksperimentalne postavke sa začepljenjem krvnih sudova od onih sa udarcem.

Šta su modeli TBI zapravo ispitivali

Nije objavljeno nijedno ispitivanje metilenskog plavog kod traumatske povrede mozga na ljudima. Svi podaci o TBI potiču iz istraživanja na životinjama, uglavnom pacovima i miševima, i grupišu se oko malog broja eksperimenata koje vredi navesti, jer se njihovi detalji razlikuju na načine koje sažeci brišu.

Najranija studija kontrolisanog kortikalnog udara davala je pacovima 1 mg/kg intravenski jedan sat nakon blagog udarca, zatim 0.5 mg/kg nakon tri sata (Watts, 2014). Zapremina lezije na MRI ostala je manja kod tretiranih životinja tokom dve nedelje praćenja. Broj pogrešnih koraka na testu hodanja značajno se smanjio 1, 2. i 7. dana, ali ne i 14. dana. Pri mikroskopskom pregledu 14. dana, broj degenerišućih neurona u povređenom korteksu iznosio je 270 naspram 368 po vidnom polju, a broj slučajeva abnormalnog Nislovog bojenja 41 naspram 73. Drugim rečima, postojala je rana zaštita, dok je prednost u ponašanju slabila do druge nedelje.

Eksperimentalna postavka sa difuznom povredom koristila je perkusiju tečnošću po srednjoj liniji kod miševa i jednu intravensku dozu od 2 mg/kg u roku od pola sata (Fenn, 2015). Tretirane životinje imale su manje izraženu ekspresiju gena povezanih sa upalom, manje mikroglijalnih ćelija u inflamatornom stanju, manje uočljivog edema i nisu pokazivale ponašanje nalik depresiji 7. dana. Podjednako su važni nalazi bez efekta: sama povreda samo je umereno povećala sadržaj vode u mozgu, a metilensko plavo nije sprečilo gubitak telesne mase niti popravilo deficit motoričke koordinacije. Antiinflamatorno delovanje nije isto što i potpuna zaštita.

Dve studije na miševima koristile su isti raspored, 1 mg/kg nakon jednog sata, 0.5 mg/kg nakon šest sati, zatim svakodnevnu primenu tokom tri dana, i proširile ispitivanje mehanizma. U modelu kortikalnog udara tretman je smanjio zapreminu lezije nakon 24 sata, 72 sata i 14. dana, uz očuvanje neurona i povećanje markera autofagije (Zhao, 2016). U modelu perkusije tečnošću smanjio je apoptozu neurona, smanjio propustljivost krvno-moždane barijere i poboljšao rezultate neurološke procene tokom dve nedelje (Shen, 2019). Međutim, sadržaj vode u mozgu nije pokazao razliku nakon 72 sata u studiji Zhao, a učinak na rotarodu nije pokazao razliku 1. i 3. dana u studiji Shen. Ishodi vezani za leziju i preživljavanje ćelija menjali su se; otok i rani motorički ishodi nisu ih uvek pratili.

U pogledu vremena primene izdvaja se eksperiment sa odloženim davanjem (Watts, 2016). Uz isti model udara, prva doza nije data sve do 24 sata nakon povrede. Do 2. dana, grupa sa odloženom primenom pokazala je smanjenja lezija uporediva sa životinjama tretiranim u prvim satima, a smanjenje se održalo 7. i 14. dana. Signal u ponašanju bio je slabiji: poboljšanje u broju pogrešnih koraka u grupi sa odloženom primenom predstavljalo je trend koji nije bio statistički značajan. Jedna laboratorija, jedan model, jedan vremenski prozor od 24 sata. To jeste stvarni dokaz da se prozor proteže dalje od prvih sati, ali je ujedno i celokupan dokaz za tu tvrdnju. Obratite pažnju na zamku u reči „odloženo” na drugim mestima: ruska serija radova sa odloženom neuroprotekcijom u naslovu davala je dozu nakon 30 minuta i koristila „odloženo” u značenju dugotrajnih ishoda, a ne kasnog početka primene.

Manja studija fokalne povrede kod pacova dopunjuje sliku o vremenu primene iz drugog pravca: i davanje neposredno pre povrede i davanje 30 minuta nakon nje smanjili su poremećaj funkcije udova (Stelmashook, 2019). Prethodni tretman funkcioniše u laboratoriji upravo zato što laboratorija određuje vreme povrede.

Ovde je važno pažljivo razmatranje doza. Pregledni radovi opisuju niske doze kao stimulativne za mitohondrijsko disanje, a visoke kao inhibitorne, što je isti dvofazni obrazac koji se vidi u farmakologiji metilenskog plavog. Zato se rezultati ne mogu čitati kao „više plavog, više oporavka”. Svaka studija ispituje jednu tačku na krivoj. Objašnjenje odnosa doze i odgovora prati tu krivu kroz različite modele, a profil bezbednosti i neželjenih efekata opisuje šta više doze rade umesto toga.

Čitajte tabelu po redovima: isto jedinjenje, tri različite vremenske skale. Prevencija pripada srednjem redu, neposredni tretman prvim dvema, a odloženi ishodi prvom i trećem.

Prevencija, neposredni tretman, odloženi ishodi

Tvrdnju o prevenciji najlakše je pogrešno razumeti. U modelima ishemije životinje koje dobiju jedinjenje pre okluzije krvnog suda prolaze bolje, a taj rezultat se ponekad navodi kao da metilensko plavo štiti svaki mozak od svakog budućeg oštećenja. On to ne pokazuje. Pokazuje da mitohondrije pripremljene alternativnim putem za elektrone bolje podnose unapred planiran gubitak protoka krvi. Niko ne planira povredu glave.

Dokazi o TBI uglavnom su usredsređeni na neposredni tretman. Primena u satima nakon udarca cilja kaskadu sekundarnog oštećenja dok ona još traje: energetski zastoj, oksidativni stres, upalu i otok. Poboljšanja ishoda vezanih za leziju i edem ovde jesu stvarni efekti tretmana, ali reč je o tretiranju procesa, a ne o popravljanju pokidanog tkiva.

Odloženi ishodi predstavljaju treći koncept. Ponašanje mereno nedeljama nakon povrede ili procesi povezani sa proteinima mereni mesecima nakon početka degenerativnog modela odgovaraju na pitanje da li se rana zaštita održala ili su spori procesi promenili tok. Manja lezija nakon 24 sata, statistički neznačajan trend u ponašanju nakon doze odložene za 24 sata i poboljšanje učinka u lavirintu posle više meseci hronične primene tri su različite tvrdnje sa tri različita zahteva za dokazima, a samo prva trenutno ispunjava svoj zahtev u više od jedne studije.

Šta ovi dokazi ne mogu da pokažu

Svaki navedeni rezultat ima isto ograničenje. Mitohondrije glodara reaguju na metilensko plavo na načine koji možda važe i za ljudske mitohondrije, ali pacov koji dobije intravensku dozu nekoliko minuta nakon precizno kontrolisanog udarca nije isto što i osoba koja stiže u urgentni centar nekoliko sati nakon pada. Anestezija, kontrolisana težina povrede, mlade zdrave životinje i kratko praćenje ograničavaju prenosivost nalaza. Ne postoji nijedna studija metilenskog plavog kod povrede izazvane eksplozijom, pa je vrsta povrede najrelevantnija za čitaoce iz vojske upravo ona za koju ima najmanje dokaza.

Takođe, ovde nema osnove za preračunavanje doza za ljude. Literatura o životinjama koristi intravenske i intraperitonealne puteve primene, u dozama izabranim radi eksperimentalne kontrole, a ne oralne kapi koje se prodaju u maloprodaji. Ništa u ovim studijama ne određuje režim primene za ljude, niti se ovde metilensko plavo ispituje uz standardno zbrinjavanje povrede glave.

Zato pošten sažetak staje u jedan pasus. Kod glodara, metilensko plavo dato približno u vreme traumatske ili ishemijske povrede mozga održava proizvodnju energije u mitohondrijama, a nakon tog očuvanja slede manje lezije i bolji rezultati procene oporavka. Jedna studija sa udarcem zadržala je deo efekta na leziju kada je prva doza odložena za 24 sata. Da li se išta od toga dešava u povređenom ljudskom mozgu nije ispitano, a literatura o TBI i moždanom udaru ispituje različita vremena primene prema različitim ishodima. Svako ko na osnovu ovih dokaza prodaje izvesnost dodaje sastojak koji eksperimenti nikada nisu sadržali.