Metilensko plavo i multipla skleroza: šta su ispitivala istraživanja na životinjama

Kada pretražujete metilensko plavo za MS, nailazite na radove koji deluju kao da odgovaraju na isto pitanje. Nije tako. U jednom radu metilensko plavo je davano obolelim miševima kao tretman. U drugom nijedna životinja nije njime tretirana. Metilensko plavo korišćeno je kao plava boja na tankim presecima kičmene moždine kako bi patolog mogao da vidi mijelin pod mikroskopom.

Na toj razlici zasniva se ceo članak. Ova boja ima dve uloge u biologiji, a jedino što im je zajedničko jeste bočica. Kao potencijalni lek, daje se živoj životinji u određenoj dozi, a pitanje je da li se tok bolesti menja. Kao boja, nanosi se na mrtvo, fiksirano tkivo nakon eksperimenta, a pitanje je kako je tkivo izgledalo. Ako previdite tu razliku, odeljak o patološkim metodama čitaćete kao da predstavlja rezultat tretmana.

Šta je EAE, jednostavno rečeno

Eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis, obično skraćen na EAE, standardni je životinjski model za pojedine aspekte multiple skleroze. Istraživač imunizuje podložnog miša fragmentom mijelinskog proteina uz snažan adjuvans. Imunski sistem zatim napada sopstveni centralni nervni sistem životinje. Kod miša se razvija uzlazna slabost koja se lako ocenjuje na skali od 0 do 5, od mlitavog repa do paralize zadnjih ekstremiteta.

Ta jednostavnost ocenjivanja objašnjava zašto je EAE popularan, ali i zašto može da zavara. MS kod ljudi nastaje spontano, obuhvata širi i manje jasno definisan skup meta i izaziva vidne, senzorne, kognitivne, cerebelarne i motorne simptome, uz relapsni ili progresivni tok. EAE reprodukuje odabrane mehanizme, poput zapaljenja, demijelinizacije i oštećenja aksona, u kontrolisanim uslovima. Ne reprodukuje MS u malom. Čitaoci koji žele opšti okvir mogu da razmotre pretpostavljene načine delovanja metilenskog plavog na ćelijskom nivou pre nego što procene bilo koju pojedinačnu tvrdnju o bolesti.

Dva rada u nastavku koristila su i različite antigene za EAE, što je važno. U studiji tretmana bolest je izazvana pomoću MOG35-55, kratkog peptida iz mijelinskog oligodendrocitnog glikoproteina. U studiji patologije bolest je izazvana pomoću MP4, fuzije segmenata mijelinskog baznog proteina i proteolipidnog proteina. Izbor soja i antigena menja mesta na kojima se lezije pojavljuju i ponašanje zapaljenja, pa ove dve studije nisu dva ponavljanja istog eksperimenta.

Pregled: od modela preko pitanja do ograničenja

Držite ovu tabelu otvorenom. Ona je polazni pregled za ovaj članak. Svaki red navodi na koje kliničko pitanje model može da odgovori, šta je zaista mereno i gde prestaje mogućnost prenošenja nalaza na ljude.

Svako ko proverava sledeći naslov može ponovo da upotrebi iste kolone uz pomoć vodiča kako čitati pretkliničke studije: proverite vrstu i antigen, ulogu jedinjenja, ishode i da li rezultat prikazuje tok bolesti ili stanje tkiva u jednom trenutku.

Rezultat tretmana: šta je primena promenila

U studiji tretmana iz 2016. objavljenoj u časopisu Journal of Neuroimmunology korišćene su ženke miševa C57BL/6, stare oko 8 do 10 nedelja, imunizovane sa 250 mikrograma MOG35-55 po mišu. Nakon izazivanja bolesti, životinje sa EAE nasumično su raspoređene u grupu koja je primala metilensko plavo ili u netretiranu grupu sa EAE, a kliničke ocene praćene su približno do 30. dana.

Kliničke ocene bile su značajno niže kod tretiranih miševa nego kod kontrolnih miševa sa EAE od 15. do 30. dana, uz P manje od 0.01. Analiza kičmene moždine ukazivala je na isto, uz manju zapaljensku infiltraciju, manju demijelinizaciju i manji gubitak aksona kod tretiranih životinja.

Posebnost studije bio je skup merenja signalnih puteva. Tretman je povećao aktivaciju AMPK i ekspresiju SIRT1, a potisnuo aktivaciju NF-kB, ključnog prekidača zapaljenskih procesa. U okviru adaptivnog imuniteta smanjio je odgovor Th17 i pojačao odgovor Treg. Predloženi sled je, dakle: metilensko plavo, zatim AMPK i SIRT1, zatim smanjena signalizacija NF-kB, zatim pomeranje od zapaljenskog Th17 ka regulatornom Treg, zatim blaže oštećenje tkiva i na kraju niže ocene.

Taj sled je tumačenje, a ne dokazan uzročni niz. Studija pokazuje da primena leka, promene u signalnim putevima i poboljšanje bolesti idu zajedno. Ne dokazuje da AMPK i SIRT1 posreduju u celokupnom povoljnom efektu, a javno indeksirani tekst ne navodi tačnu dozu u miligramima po kilogramu, put primene, dan početka ni trajanje dovoljno jasno da bi se režim mogao reprodukovati samo na osnovu sažetka. Svaku brojčanu dozu koja se za ovaj rad navodi na prodajnoj stranici smatrajte neproverenom, osim ako je potkrepljena citatom metoda iz punog teksta. Širi skup dokaza o metilenskom plavom kod ljudi mesto je za proveru da li su ovi rani nalazi o imunskim signalnim putevima ikada doveli do kliničkih podataka.

Rezultat patološke analize: šta je tkivo pokazalo tokom šest meseci

U studiji MP4 iz 2015. objavljenoj u časopisu PLoS ONE korišćene su ženke miševa C57BL/6 imunizovane sa 200 mikrograma MP4 u kompletnom Frojdovom adjuvansu, uz toksin pertusisa na dan imunizacije i ponovo 48 sati kasnije. Nijedna životinja nije primila metilensko plavo kao lek. Nakon fiksacije i uklapanja, poprečni preseci kičmene moždine debljine jednog mikrometra obojeni su metilenskim plavim za svetlosnu mikroskopiju, dok je ventrolateralni trakt pregledan elektronskom mikroskopijom radi finijih detalja.

Tkivo je uzorkovano u tri faze: na vrhuncu akutne faze kod 7 miševa, tri meseca nakon početka kod 5 miševa i šest meseci nakon početka kod 10 miševa. Prosečne kliničke ocene u tim fazama izgledale su gotovo identično, oko 1.7 do 1.8 na skali od 0 do 5. Tkivo je pokazalo drugačiju sliku. Broj vlakana sa izolovanim oštećenjem mijelina porastao je sa oko 569,000 po kvadratnom milimetru na vrhuncu akutne faze na oko 1,496,000 nakon šest meseci, pri čemu je poređenje akutne i dugoročne faze bilo značajno, uz P jednako 0.027. Kombinovano oštećenje mijelina i aksona približno se udvostručilo do šestog meseca. Vlakna u procesu remijelinizacije ostala su ispod jednog procenta u svakoj fazi, što je otrežnjujući podatak za nade u obnovu.

Oštećenje aksona pratilo je obrazac u obliku slova U: bilo je veliko na vrhuncu akutne faze, manje nakon tri meseca, a najveće nakon šest meseci. Bilo je povezano sa oticanjem mitohondrija i smanjenim razmakom između neurofilamenata. Procena je sprovedena bez znanja o kliničkoj oceni i fazi, što dodatno podržava tumačenje da kliničke ocene nisu u potpunosti odražavale strukturno oštećenje koje se nastavljalo.

Taj nesklad je stvarni doprinos studije čitaocu zainteresovanom za MS. Stabilna ocena onesposobljenosti nije značila stabilno stanje tkiva. To pokazuje i zašto ovaj rad ne može da potkrepi bilo kakvu tvrdnju o metilenskom plavom kao tretmanu za MS. Ispitivao je vreme, a ne tretman.

Zašto nijedna studija ne utvrđuje korist kod pacijenata

Posmatrajte svaki rad kao dobar odgovor na usko pitanje, ali ne i kao odgovor na pitanje koristi kod pacijenata.

Prvo, uzrok se razlikuje. EAE se namerno izaziva definisanim antigenom i adjuvansom. MS kod ljudi razvija se spontano, uz širi imunski repertoar koji uključuje T ćelije, B ćelije, urođeni imunitet i rezidentnu gliju. Jedinjenje koje menja odgovor usmeren ka MOG-u kod miša ne mora da menja taj širi odgovor kod ljudi.

Drugo, fenotip se razlikuje. Uzlazna slabost koja se kod miša širi od repa ka zadnjim ekstremitetima praktičan je pokazatelj. Ona svodi heterogenost MS kod ljudi na jednu brojčanu meru motorne funkcije. Lekovi često menjaju kratkoročne ocene EAE, a da ne menjaju tok bolesti kod ljudi, zbog čega je EAE alat za početno ispitivanje i proučavanje mehanizama, a ne kliničko ispitivanje u malom.

Treće, izloženost i vreme primene ostaju nerazjašnjeni. Kontinuirana primena od rane faze u eksperimentu na miševima koji traje 30 dana nije isto što i hronična oralna upotreba kod osobe sa već razvijenom bolešću, a nijedna studija nije merila nivoe leka u nervnom sistemu. Bez te veze nema osnove za prelazak sa koncentracije u laboratorijskoj ploči ili doze kod miša na režim primene kod ljudi.

Četvrto, ova dva rada ne ponavljaju jedan drugog. Različiti antigeni, različita pitanja, različiti ishodi, a u jednom slučaju uopšte nema tretmana. Citirati ih zajedno kao dve pozitivne studije tretmana MS znači pogrešno ih svrstati u istu kategoriju.

Šta ovo znači za čitaoce koji procenjuju dokaze

U ovim radovima nema utvrđenog protokola primene metilenskog plavog za MS. Studija tretmana podržava dalja istraživanja AMPK, SIRT1, NF-kB i ravnoteže Th17 prema Treg u modelu MOG EAE. Studija patologije podseća da oštećenje tkiva može da napreduje dok ocene izgledaju nepromenjeno i da metilensko plavo u odeljku o metodama ponekad znači posudu sa bojom, a ne ormarić sa lekovima. Čitaoci koji prate aktuelna istraživanja multiple skleroze treba da imaju na umu tu razliku između boje i leka. Pitanja bezbednosti, uključujući rizike po krv i rizike od interakcija, treba razmotriti u razgovoru sa lekarom, zajedno sa opštim podacima o bezbednosti metilenskog plavog, pre nego što bilo ko postupi na osnovu naslova o laboratorijskim nalazima.

Zaključak staje u jednu rečenicu. U jednoj citiranoj studiji metilensko plavo je davano miševima sa MOG EAE i prijavljena je blaža bolest uz protivzapaljensko pomeranje imunskog odgovora, dok u drugoj citiranoj studiji ništa nije davano kao tretman, a metilensko plavo je korišćeno samo za bojenje kičmene moždine tokom dokumentovanja šest meseci nagomilavanja oštećenja mijelina i aksona, pa ova dva rada ne dokazuju da metilensko plavo pomaže kod MS kod ljudi.