Metilensko plavo i feroptoza: gvožđe, lipidna peroksidacija i ćelijska smrt

Feroptoza je ćelijska smrt usled oštećenja membrane. Polinezasićene masti u membranama oksiduju u lančanoj reakciji, membrana gubi funkciju i ćelija umire. Za tu hemijsku reakciju neophodno je gvožđe. Ta rečenica obuhvata ceo koncept, a sve u ovom članku predstavlja ispitivanje nekog njegovog dela.

Ovde je pitanje uže: kako metilensko plavo utiče na taj lanac u eksperimentima na ćelijama i šta taj rezultat zapravo pokazuje. Kratak odgovor je da je u dve laboratorijske studije metilensko plavo u nanomolarnim koncentracijama smanjilo mitohondrijsku lipidnu peroksidaciju i održalo ćelije u životu nakon izlaganja okidačima koji inače izazivaju feroptozu. Duži odgovor je važniji, jer je svaka karika u lancu ispitana drugačijom intervencijom, a svaka intervencija ima ograničenja.

Feroptoza u jednom pasusu

Membranski fosfolipid koji nosi rep polinezasićene masne kiseline ima slabu tačku: atome vodonika koji se lako mogu oduzeti. Kada radikal oduzme jedan od njih, kiseonik se vezuje za lipid, nastaje lipidni peroksilni radikal, a taj radikal oduzima vodonik sledećem lipidu. Reakcija se širi duž membrane ako je nešto ne zaustavi.

Glavni mehanizam zaustavljanja je enzim GPX4, koji koristi glutation da redukuje lipidne perokside u bezopasne lipidne alkohole. Laboratorijski okidači napadaju ovu odbranu na tačno određenim mestima. Erastin blokira unos cistina kroz sistem xc-minus, čime ćeliju lišava cisteina potrebnog za sintezu glutationa. Butionin sulfoksimin direktno blokira sintezu glutationa. RSL3 inhibira sam GPX4. Sva tri ostavljaju perokside neuklonjenim, ali deluju u različitim koracima, pa se rezultat dobijen sa jednim okidačem ne može automatski preneti na ostale.

Feroptoza se razlikuje od apoptoze po osobinama koje je definišu. Nema kaspazne kaskade niti apoptotičnih tela. Helatori gvožđa, poput deferoksamina, i sredstva koja hvataju radikale, poput ferostatina-1, suzbijaju je, što je operativni test kojim istraživači utvrđuju da je smrt feroptotična, a ne samo nekrotična. Širi pregled puteva regulisane ćelijske smrti stavlja ovu razliku u kontekst, a način na koji ćelije upravljaju labilnim gvožđem objašnjava zašto je helacija toliko presudna kontrola.

Gde se uklapaju mitohondrije i zašto je to bilo sporno

Rani radovi su izvestili da ćelije bez mitohondrijske DNK i dalje prolaze kroz feroptozu, što je ukazivalo na to da mitohondrije nisu neophodne. Kasniji radovi su pokazali da smanjenje broja mitohondrija ili blokiranje respiracije može suzbiti feroptozu izazvanu nedostatkom cisteina, ali ne i onu izazvanu direktnom inhibicijom GPX4. Oba rezultata mogu biti tačna ako doprinos mitohondrija zavisi od okidača, tipa ćelije i mesta na kojem se odvija presudna peroksidacija.

Studija na kojoj se ovaj članak zasniva pristupila je ovom sporu pomoću sonde specifične za određeni ćelijski odeljak. MitoCLox je verzija indikatora lipidne peroksidacije usmerena na mitohondrije: menja fluorescenciju kada naiđe na lipidne peroksilne radikale unutar mitohondrija. U fibroblastima tretiranim erastinom, oksidacija mitohondrijske sonde pojavila se u još živim ćelijama pre smrti i nije bila ujednačena u celoj populaciji. Taj vremenski sled je važan. Peroksidacija koja prethodi smrti može biti njen uzrok. Peroksidacija izmerena samo u mrtvim ćelijama predstavlja ostatke oštećenja. Prateći vodič o testovima lipidne peroksidacije i tome šta svaka sonda pokazuje objašnjava zašto lokacija sonde određuje značenje signala.

Isti obrazac pojavio se i u drugom modelu. Fibroblasti pacijenta sa Leberovom naslednom optičkom neuropatijom, koji nose mutaciju kompleksa I i imaju viši početni nivo oksidativnog stresa, umirali su feroptozom kada je glutation iscrpljen, dok su kontrolni fibroblasti bili otporni. Oksidacija mitohondrijske sonde ponovo je prethodila smrti. Detalji su dati u studiji mitohondrijske lipidne peroksidacije u feroptozi na fibroblastima.

Šta je metilensko plavo promenilo u ovim eksperimentima

Metilensko plavo je redoks prenosilac. Njegov oksidovani oblik prihvata elektrone iz reakcija povezanih sa NADH na kompleksu I, a redukovani oblik ih predaje citohromu c, koji ih prosleđuje kompleksu IV. Time nastaje delimičan zaobilazni put oko segmenta lanca u kojem elektroni obično prelaze na kiseonik stvarajući superoksid. Čitaoci koji žele potpunu sliku ovog prenosa treba da počnu od objašnjenja kako metilensko plavo prenosi elektrone kroz mitohondrije.

U plućnim fibroblastima tretiranim erastinom, metilensko plavo pri koncentraciji od 250 nanomolara očuvalo je vijabilnost u testu preživljavanja ćelija, kao i antioksidansi usmereni na mitohondrije SkQ1 i MitoTEMPO. Kontrole određuju granice ove tvrdnje. Ferostatin-1, alfa-tokoferol i deferoksamin takođe su pružili zaštitu, što potvrđuje da je smrt bila feroptotična. Analog SkQ1 bez antioksidativne grupe nije pružio zaštitu, što ukazuje na redoks reakcije, a ne na nespecifično nakupljanje. Zaštita je slabila iznad približno 200 nanomolara SkQ1, u skladu sa poznatim prooksidativnim ponašanjem hinonskih antioksidanasa pri većim koncentracijama. Metilensko plavo pokazuje isto dvojako ponašanje zavisno od doze: u ovim kulturama deluje zaštitno pri niskim nanomolarnim koncentracijama, a pri višim koncentracijama ili jakom osvetljenju može stvarati vodonik-peroksid kroz redoks cikluse. Ovakav kontekst doze obrađen je u članku o reaktivnim vrstama kiseonika u mitohondrijama.

Eksperimenti sa izolovanim mitohondrijama zatim su razdvojili izvore ROS. U prisustvu dvovalentnog gvožđa, supstrati koji snabdevaju kompleks I zajedno sa rotenonom podsticali su oksidaciju sonde. Rotenon blokira tok elektrona nizvodno od flavinskog mesta, pa uzvodni prenosioci ostaju redukovani, a elektroni sa flavina okrenutog ka matriksu prelaze na kiseonik. Supstrati koji snabdevaju kompleks III zajedno sa antimicinom A stvarali su velike količine vodonik-peroksida, ali nisu pokretali lipidnu peroksidaciju. Isti ukupni ROS signal, druga lokacija, drugačiji ishod. I SkQ1 i metilensko plavo suzbijali su peroksidaciju pokrenutu kompleksom I, a da pritom nisu suzbijali samu proizvodnju vodonik-peroksida, što njihovo delovanje smešta nakon nastanka ROS, u korak lipidne peroksidacije.

Eksperimenti sa preopterećenjem gvožđem i trag koji pruža lipofuscin

Druga studija pristupila je pitanju sa strane gvožđa. U H9c2 kardiomiocitima izloženim submilimolarnim koncentracijama amonijum-citrata trovalentnog gvožđa nastali su mitohondrijski ROS, zatim mitohondrijska lipidna peroksidacija i feroptoza, praćene nakupljanjem pigmenta nalik lipofuscinu u roku od 24 sata. Lipofuscin je autofluorescentni ostatak oksidovanih lipida i proteina koji sadrži gvožđe i nakuplja se sa godinama, a njegova brza pojava ovde povezuje akutnu peroksidaciju pokrenutu gvožđem sa klasičnim markerom starenja. I metilensko plavo u nanomolarnim koncentracijama i SkQ1 sprečili su peroksidaciju, smrt i nakupljanje pigmenta. Izolovane srčane mitohondrije potvrdile su obrazac: rotenon zajedno sa dvovalentnim gvožđem pokretao je peroksidaciju i signal nalik pigmentu, a oba sredstva su to blokirala. Ceo sled opisan je u studiji preopterećenja gvožđem u H9c2 kardiomiocitima. Deo priče o pigmentu povezan je sa temom lipofuscina i markera ćelijskog starenja.

Šta testovi preživljavanja ćelija ne pokazuju

Test vijabilnosti poput CellTiterBlue pokazuje koliko ćelija u kulturi ostaje metabolički aktivno nakon izlaganja okidaču i potencijalnom zaštitnom sredstvu. To je ispitivanje mehanizma u definisanom sistemu. Nije ishod lečenja. Ni u jednom od ovih eksperimenata sredstvo nije dato pacijentu, nije meren klinički ishod bolesti niti je utvrđen terapijski prozor u organizmu.

Četiri ograničenja treba izričito navesti. Prvo, izbor tipova ćelija je uzak: transformisani plućni fibroblasti, primarni kožni fibroblasti uključujući jednu liniju sa mitohondrijskom bolešću i linija kardiomiocita pacova, uz izolovane mitohondrije srca pacova. Osetljivost se razlikovala između linija, a linija LHON bila je namerno odabrana kao neuobičajeno osetljiva. Drugo, okidači predstavljaju laboratorijske ekstreme: potpunu blokadu transporta ili sinteze i opterećenja gvožđem kojima nijedno tkivo ne bi bilo akutno izloženo. Treće, koncentracija se ne može pretvoriti u dozu prostim množenjem. Nanomolarna koncentracija u medijumu za kulturu nije doza za čoveka, a raspodela metilenskog plavog, njegova redukcija u bezbojni oblik u krvi i tkivu, izloženost svetlosti i membranski potencijal nalaze se između ćelijske kulture i čoveka. Četvrto, sonde daju informacije o sopstvenom ćelijskom odeljku. Oksidacija MitoCLox pokazuje da su nastali mitohondrijski lipidni radikali; ne pokazuje da je pucanje plazma-membrane, verovatni završni događaj, sprečeno direktno, a ne izbegnuto delovanjem u nekom ranijem koraku.

Zato je opravdana tvrdnja sledeća: u ovim modelima ROS poreklom iz kompleksa I zajedno sa gvožđem pokreću mitohondrijsku lipidnu peroksidaciju koja prethodi feroptozi, a metilensko plavo u niskim koncentracijama prekida taj segment. Sve što prevazilazi taj segment zahteva drugačije eksperimente na životinjama, a zatim i na ljudima.